抗菌药物敏感试验

.,1,抗菌药物敏感性概述抗菌药物敏感性试验方法全国“细菌耐药监测网”简介,.,2,敏感和耐药的概念,从本质上讲：细菌对某种抗菌药物是敏感还是耐药，常以该抗菌药物的治疗浓度与MIC的关系而定。,常用剂量的抗菌药物通过常用途径所能达到的血药浓度,.,3,血药浓度与MIC之间的关系,敏感,中介耐药,耐药,上限,下限,.,4,抗菌药物的治疗浓度与MIC的关系：若MIC小于治疗浓度，则为“敏感”（Sensitive,S），推荐使用。若MIC大于治疗浓度，则为“耐药”（Resistant,R）；若MIC介于治疗浓度的上下限之间，则为“中度耐药”（Intermediate,I）或中度敏感,敏感和耐药的概念,.,5,.,6,敏感,治疗浓度的上限即表中的R,治疗浓度的下限即表中的S,耐药,中介耐药,治疗浓度,CLSI标准,MIC,.,7,第一节、抗菌药物敏感性试验方法,需氧和兼性厌氧菌,.,8,稀释法肉汤稀释法（试管稀释法）琼脂稀释法（平板稀释法）纸片扩散法（纸片法）E-试验联合药物敏感试验,需氧和兼性厌氧菌药敏试验的方法,.,9,稀释法的特点,定量的药敏试验，测定MIC、MBC。方法比较繁琐，手工操作一般不作为常规试验，常用于调查罕见耐药。自动微生物鉴定药敏分析系统采用微量稀释法检测MIC。,.,10,二、纸片扩散法（discdiffusiontest)（Kirby-Bauer法）,原理：将浸有抗菌药物的纸片贴在涂有测试菌的琼脂平板上。抗菌药物向琼脂四周扩散形成递减的梯度浓度。药物敏感细菌在纸片周围一定距离内的生长受到抑制，形成抑菌圈。抑菌圈的大小反映测试菌对药物的敏感程度。二者呈正相关。,.,11,抑菌圈边缘的药物浓度与MIC,.,12,抑菌圈的大小与MIC：二者呈负相关，即抑菌圈愈大，MIC愈小。,.,13,纸片法药敏试验抑菌圈直径与结果解释的标准,.,14,操作方法：1.制备M-H琼脂平板，厚度4mm。2.制备0.5麦氏比浊管浊度的菌液（培养1624h，45个菌落）。3.菌液均匀涂布于平板。（15分钟接种完毕）4.无菌贴标准抗生素纸片于M-H琼脂表面，5.经过351624h孵育。6.量取抑菌环直径，根据CLSI标准，报告细菌对该抗生素敏感、耐药、中介。,.,15,操作方法：1.将在约56恒温的无菌M-H琼脂倾注直径为90mm的平板，其厚度4mm。,.,16,2.无菌挑取孵育1624h的血平板上45个菌落。,.,17,3.将菌置于无菌生理盐水中，校正其浊度于0.5麦氏比浊管浊度的菌液。,1.5108CFU/ml,.,18,4.用无菌棉签浸入细菌悬液中，将拭子在试管上壁轻轻挤压以挤去过多的菌液。棉签在三个方向均匀抹琼脂表面（每次转60）使菌液均匀分布，最后沿平板内缘涂抹一周。,.,19,5.盖上平板的盖子，放置培养箱内孵育，放置310分钟后贴上标准抗生素纸片。,.,20,6.用无菌镊子或纸片分配器将抗菌纸片粘贴于M-H琼脂的表面，一旦纸片贴上，不能移动；各抗菌纸片中心距离应大于24mm，纸片距平板内缘应大于15mm。,.,21,7.经过351624h孵育。,8.取抑菌环直径，根据CLSI标准，报告细菌对该抗生素敏感、耐药、中介。,.,22,纸片扩散法质量控制,培养基：M-H平板厚度，4mm细菌悬液：0.5麦氏标准的细菌浓度药敏纸片的质量各抗菌纸片中心距离应大于24mm，纸片距平板内缘应大于15mm。9cm的平板贴6个培养时间质控菌株,抑菌圈直径？,.,23,.,24,根据抑菌圈的直径，依照CLSI标准，作出敏感、耐药、和中介的判断。为定性”结果。CLSI推荐的最简单的药敏试验。,纸片扩散法的特点,.,25,三、E试验法（浓度梯度法）,原理：E试条是一条5mm50mm无孔试剂载体，一面固定有一系列预先制备的浓度呈连续指数增长的抗菌药物，另一面有判别的刻度。抗菌药物的梯度可覆盖有15-20个对倍稀释浓度的宽度范围。将E试条放在细菌接种过的琼脂平板上，经孵育，围绕试条明显可见椭圆形抑菌圈，圈的边缘与试条交点的刻度浓度即为抗菌药物抑制细菌的MIC。依照CLSI标准判断其敏感、耐药、中介。,2561288016,.,26,无菌生长区,有菌生长区,.,27,椭圆形细菌生长抑制区,2561288016,判读抑菌浓度（MICug/ml),.,28,.,29,.,30,Etest法特点,优点连续浓度梯度，与琼脂稀释法相关性好（相关系数为0.9）.可测MIC。操作简单，影响因素少，稳定性高。缺点：E试条较昂贵;不适用于生长缓慢的苛养菌。,.,31,用于病原菌尚未确定的急、重症感染的经验治疗,以扩大病原治疗的覆盖面治疗多种细菌所引起的混合感染对于某些耐药菌可取得协同抗菌作用减少或推迟治疗过程中细菌耐药性的产生避免药物达到毒性剂量。,四、联合药物敏感试验,联合药物意义,.,32,增强作用：两种抗生素联用的效果大于它们单独使用时的效果之和；2025相加作用：它们联用时的效果等于单用两种抗生素效果之和；6070无关作用：两种抗生素联用的效果，仅相当于其中一种具有较强作用的抗生素的效果；拮抗作用：两种抗生素联用时的效果反而小于它们分别使用时的效果之和。1015,两种药物的联合使用的效果,.,33,两种抗菌药物作用部位不同：内酰胺类抗生素（抑制细菌细胞壁合成）与氨基糖苷类抗生素（干扰细菌的代谢）。增强作用：增加了药物进入细菌细胞杆菌肽（降低细胞通透性）与氨基糖苷类药物（干扰细菌的代谢）。拮抗作用：降低了药物进入细菌细胞,抗菌药物协同作用发生原理,.,34,棋盘稀释法利用肉汤稀释法原理，依据两种药物的MIC，以棋盘设计两种药物不同浓度的组合。计算抑菌浓度指数（fractioninhaibitoryconcentration,FIC),联合药物敏感试验方法,.,35,棋盘稀释法,首先分别测定拟联合的抗菌药物对检测菌的MIC。药物最高浓度为MIC的2倍，对倍稀释。两种药物的稀释分别在方阵的纵列和横列进行，这样在每管（孔）中可得到不同浓度组合的两种药物混合液。接种菌量为5105CUFml，35孵育18h后观察结果。计算部分抑菌浓度（FIC）指数。,.,36,抑菌浓度指数（FIC）,FIC,A药联合时的MIC,A药单测的MIC,B药联合时的MIC,B药单测的MIC,FIC0.5为协同作用；0.51为相加作用；12为无关作用；2为拮抗作用,.,37,A药：321684,B药:16842,生长,生长,生长,生长,生长,生长,生长,生长,生长,生长,生长,.,38,药敏试验方法的比较,K-B法：WTO推荐使用的最简单的定性药敏试验。稀释法：准确测定MIC、MBC，比较繁琐，试管法一般不作为常规试验。微生物自动分析系统采用微量稀释法原理。E试验：可测定MIC。,.,39,第二节结核分枝杆菌的药敏试验（了解）,首次分离的分枝杆菌需做药敏试验，有助于合理用药和监测药物敏感性。另外经过三个月正规治疗，标本分离培养仍为阳性患者，或感染的严重疾患（如播散性结核病和结核性脑膜炎）。以及来自高耐药流行区的患者，均须做体外药敏试验。,.,40,四种方法,比例法放射同位素法绝对浓度法耐药率法,直接法：直接采用图片阳性的体液标本。（须经充分消化五杂菌）间接法：经分离纯培养后的次代培养菌。,.,41,无药,药2,药3,药1,Middlebrook7H10琼脂培养3周,间接比例法（WHO推荐）,敏感：含药格无结核杆菌生长，或菌落数1%对照格耐药：含药格菌落数1%对照格。,不含药的对照格菌落数应为50150,4格平板,.,42,分枝杆菌微量直视快速药敏试验法,4000倍,.,43,培养72h观察结果,INH敏感,RFP耐药,阳性对照,阴性对照,.,44,第三节厌氧菌体外药敏试验（了解）,厌氧菌感染多为内源性感染，厌氧菌药物敏感性稳定，一般不做体外药敏试验。下述情况应考虑药敏试验：明确厌氧菌引起的严重感染；已确证的厌氧菌感染，经验性选药治疗未能奏效；需长期用药的厌氧菌感染。,.,45,基本原理和方法与需氧菌相同，只是在培养基、操作环境和培养条件等应根据厌氧菌的特定需要变动。培养基为布氏血琼脂再加人补充剂5g/ml氯化血红素，5脱纤维羊,1g/mlVitK。厌氧孵育条件质控菌株为脆弱类杆菌ATCC25285。,厌氧菌体外药敏试验,.,46,药敏试验结果的临床价值,影响抗菌药物临床疗效的因素很多，据报道药敏试验结果与临床疗效的符合率约为70%，因此细菌培养及药敏试验报告只能作为临床用药的参考，应根据患者用药后的治疗反应和临床病情及时调整用药。医学检验的灵魂是与临床沟通。,.,47,新的药敏试验方法探索,流式细胞术检测抗生素最低抑菌浓度分枝杆菌药物最低抑菌浓度的快速测定方法研究,.,48,细菌耐药性的发生过程：,细菌获得与耐药相关的基因编码与耐药有关的蛋白表现出对某种抗生素的耐药,基因：537表型：书533页敏感性,.,49,第35章第三节细菌耐药性检测,.,50,生物化学技术检测酶的等电点(等电聚焦电泳)头孢哨噻吩滤纸片法碘淀粉测定法分析酶的底物谱及抑制物谱纸片法和稀释法,1、-内酰胺酶检测,临床意义：产ESBL克雷伯菌和大肠埃希菌对青霉素、头孢菌素和氨曲南治疗无效。,一、耐药表型检测,.,51,G-菌产生的头孢菌素酶检测-头孢哨噻吩滤纸片法,用接种环挑取受试菌于头孢哨噻吩（产色头孢菌素）滤纸片上(商品化)，10分钟内由浅黄色转变为粉红色即阳性结果，表示头孢菌素的-内酰胺环被酶打开。临床意义：产生该酶的细菌对头孢菌素类抗生素耐药。,.,52,G+菌产生的青霉素酶检测-碘淀粉测定法,受试菌混于青霉素溶液，振摇30分钟。加入淀粉液后，再加入碘液，溶液变蓝，继续振摇。10分钟之内蓝色消失者为产酶株。,青霉素酶,青霉素,青霉素噻唑酸,碘,碘淀粉复合物变为无色,多为金黄色葡萄球菌产生，对青霉素G耐药。,.,53,超广谱-内酰胺酶Extended-Spectyum-Lactamase，ESBLESBLs,能水解青霉素类，头孢菌素和氨曲南。不能水解碳青烯酶类，如亚胺培南多数可被内酰胺酶抑制剂（如克拉维酸，三唑巴坦及舒巴坦）所抑制。如为ESBL阳性，则对青霉素类，头孢菌素和氨曲南均报告耐药，不考虑体外药敏结果。,.,54,常见产ESBLs菌株,最常见是肠杆菌科细菌（大肠埃希氏菌、肺炎克雷伯氏菌）；其次，阴沟肠杆菌、粘质沙雷氏菌、弗劳地枸橼酸菌、铜绿假单胞菌、奈瑟菌等。,.,55,ESBLs的临床意义,对产ESBLs菌株，目前最有效的抗生素为碳青霉烯类（泰能），其次，头孢西丁及含酶抑制剂的复合剂、氨基糖甙类部分有效。若临床出现产ESBLs菌株，会在病人和医院之间及不同菌株间相互传播，应引起充分的重视。,.,56,纸片初筛：培养基：Muller-Hinton琼脂药敏纸片接种：按标准纸片扩散法孵育：35大气环境，16-18小时结果：头孢泊肟（10ug片）抑菌环22mm头孢他啶（10ug片）抑菌环22mm氨曲南（30ug片）抑菌环27mm头孢噻肟（30ug片）抑菌环27mm头孢曲松（30ug片）抑菌环25mm,超-内酰胺酶检测纸片扩散法,ESBLs的底物,可能产生ESBLs,.,57,培养基：Muller-Hinton琼脂药敏纸片浓度：头孢噻肟30ug、头孢噻肟/克拉维酸30ug/10ug头孢他啶30ug、头孢他啶/克拉维酸30ug/10ug接种：按标准纸片扩散法孵育：35大气环境，16-18小时结果：复合制剂药物纸片的抑菌圈直径比非复合制剂药物纸片的直径5mm以上者为产ESBLs菌。,ESBLs的底物ESBLs的抑制剂,(1)纸片确证试验：,.,58,混合克拉维酸药物纸片,无克拉维酸药物纸片的直径,直径差5mm：ESBL,.,59,筛选试验：选用头孢泊肟、头孢他啶、氨曲南、头孢噻肟或头孢曲松至少2种以上，用标准肉汤稀释法稀释至1g/ml,凡被测菌在上述各管中能够生长(MIC2g/ml)，高度怀疑为ESBLs，应进一步作确认试验来加以确诊。,（2）液体稀释法,.,60,确认试验：用标准肉汤稀释法测定MIC的方法,头孢噻肟单独稀释(0.2564g/ml)及头孢噻肟(稀释范围相同)加克拉维酸(每管4g/ml);头孢他啶单独稀释(0.25128g/ml)及头孢他啶加克拉维酸(每管4g/ml),上述2种药物必须同时进行试验,结果加克拉维酸和不加克拉维酸的MIC差值8倍(3个稀释度)，可确认为ESBLs菌株。,（2）液体稀释法,.,61,二、细菌耐药基因检测,基因检测方法检测细菌耐药性的优缺点抗生素耐药性的基因检测方法基因检测方法的应用,.,62,基因检测细菌耐药性的优点：,能早期指导临床医生治疗用药。分子遗传学方法可以直接从临床标本入手，无需菌株的培养，极大地节省时间，减轻实验室生物危险性。有助鉴别那些处于中介水平或常规药敏结果模棱两可的结果。分子生物学方法被认为是“金标准”。在细菌耐药性的流行病追踪调研中，耐药基因检测比抗生素敏感方法更准确。发现新的耐药基因。,.,63,基因检测方法检测抗生素耐药性的缺点：,当样品中菌量很少时，其敏感性会大大降低。对每一个测试的抗菌药物，均需要设计相应的分子检测方法，一次只能检测一种耐药机制。目前仍有许多耐药机制是未知的，无法进行分子检测。耐药基因的检测也会存在假阳性问题。对许多耐药基因的检测方法，目前还缺乏临床对照研究以评价其准确性、重复性及临床应用价值。,.,64,常见的细菌耐药相关基因举例,.,65,耐药基因检测方法：,分子方法检测耐药基因的基础是PCR。在PCR基础上发展的方法：分子杂交、DNA序列分析，基因微振列技术等。,.,66,PCR-序列特异性引物扩增耐药基因,标本,提取DNA,PCR扩增目的基因DNA,琼脂糖凝胶电泳,结果分析,1234,1234,耐药基因的的特异性引物,理想的靶序列应当是耐药基因的编码区域，而非编码区外的基因(如插入序列或启动子序列)。特异性高，需要设立阴性对照。,.,67,基因芯片技术,芯片制备：以玻璃片或硅片为载体，采用原位合成和微矩阵的方法将寡核苷酸片段或cDNA作为探针按顺序排列在载体上。样品制备：生物样品往往是复杂的生物分子混合体，须将样品进行提取、扩增，获取其中的蛋白质或DNA、RNA，然后用荧光标记，以提高检测的灵敏度和使用者的安全性。杂交反应：即荧光标记的样品与芯片上的探针进行反应产生一系列信息的过程