DNA的提取方法简介

DNA的提取方法简介,为了研究DNA分子在生命代谢中的作用，常常需要从不同的生物材料中提取DNA.由于DNA分子在生物体内的分布及含量不同，要选择适当的材料提取DNA。动植物中，小牛胸腺动物肝脏鱼类精子，植物种子的胚中都含有丰富的DNA。微生物中，谷氨酸菌体含7%10%，面包酵母含4%，啤酒酵母含6%，大肠肝菌含9%10%。,从各种材料中提取DNA方法不同，分离提取的难易程度也不同。对于低等生物。如从病毒中提取DNA比较容易，多数病毒DNA分子量较小，提取时易保持其结构完整性。从细菌及高等动植物中提取DNA难度大一些。细菌DNA分子量较大，一般达210道尔顿。因此易被机械张力剪断。细菌DNA，除核DNA外，还有质粒DNA等。,1、核酸的理化性质RNA和核苷酸的纯品都呈白色粉末或结晶，DNA则为白色类似石棉样的纤维状物。除肌苷酸、鸟苷酸具有鲜味外，核酸和核苷酸大都呈酸味。DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离酸易溶于水，RNA钠盐在水中溶解度可达40g/L。DNA在水中为10g/L，呈黏性胶体溶液。在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。,天然状态的DNA是以脱氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于细胞核中。要从细胞中提取DNA时，先把DNP抽提出来，再把P除去，再除去细胞中的糖，RNA及无机离子等，从中分离DNA。DNP和RNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响而不同。DNP在低浓度盐溶液中，几乎不溶解，如在0.14mol/L的氯化钠溶解度最低，仅为在水中溶解度的1%，随着盐浓度的增加溶解度也增加，至1mol/L氯化钠中的溶解度很大，比纯水高2倍。RNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响较小，在0.14mol/L氯化钠中溶解度较大。因此，在提取时，常用此法分离这两种核蛋白。,细菌有坚硬的细胞壁，首先要破碎经胞。方法有三种：机械方法：超声波处理法、研磨法、匀浆法；化学试剂法：用SDS处理细胞；酶解法：加入溶菌酶或蜗牛酶，都可使细胞壁破碎。,2.细胞的破碎,由于高等动物DNA主要存在于细胞核与线粒体中，所以提取时有两个困难（高等植物与此类似）：破碎细胞难；从处死动物分离组织器宫到破碎细胞费时长。在此时期间DNA可能会被DNase降解，而动物组织：特别是肌肉组织很难破碎,即使是较易破碎的肝肾等组织也往往使用组织匀浆器，易造成DNA断裂。分子量大，一般比细菌的大23个数量级，比病毒的大45个数量。对不同生物材料，要根据具体情况选择适当的分离提取方法。,3.DNA提取的几种方法(1).浓盐法利用RNP和DNP在电解溶液中溶解度不同，将二者分离，常用的方法是用1M氯纳提取化钠抽提,得到的DNP粘液与含有少量辛醇的氯仿一起摇荡,使乳化,再离心除去蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而DNA位于上层水相中,用2倍体积95%乙醇可将DNA钠盐沉淀出来.也可用0.15MNaCL液反复洗涤细胞破碎液除去RNP,再以1MNaCL提取脱氧核糖蛋白,再按氯仿-异醇法除去蛋白.两种方法比较,后种方法使核酸降解可能少一些.以稀盐酸溶液提取DNA时,加入适量去污剂,如SDS可有助于蛋白质与DNA的分离。在提取过程中为抑制组织中的DNase对DNA的降解作用,在氯化钠溶液中加入柠檬酸钠作为金属离子的烙合剂.通常用.15MNaCL,0.015M柠檬钠,并称SSC溶液,提取DNA.,（2）.阴离子去污剂法:用SDS或二甲苯酸钠等去污剂使蛋白质变性,可以直接从生物材料中提取DNA.由于细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合,因为阴离子去污剂能够破坏这种价键,所以常用阴离子去污剂提取DNA.（3）.苯酚抽提法:苯酚作为蛋白变性剂,同时抑制了DNase的降解作用.用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。离心分层后取出水层，多次重复操作，再合并含DNA的水相，利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀DNA。此时DNA是十分粘稠的物质，可用玻璃漫漫绕成一团，取出。此法的特点是使提取的DNA保持天然状态.,（4）.水抽提法:利用核酸溶解于水的性质,将组织细胞破碎后,用低盐溶液除去RNA，然后将沉淀溶于水中，使DNA充分溶解于水中,离心后收集上清液.在上清中加入固体氯化钠调节至2.6M.加入2倍体积95%乙醇,立即用搅拌法搅出.然后分别用66%80%和95%乙醇以及丙铜洗涤,最后在空气中干燥,既得DNA样品.此法提取的DNA中蛋白质含量较高,故一般不用.为除蛋白可将此法加以改良,在提取过程中加入SDS.,二.从猪脾中提取DNA,1.操作步骤:取鲜猪脾,去脂、血,称取10g,用预冷的1SSC溶液洗2次，剪碎。按睥：1SSC=1;5W/V加入50ml预冷的1SSC，用高速组织捣碎机破碎8次,每次5秒,中间间隔30秒。将匀浆液放在烧杯中，于冰盐浴中冷却30分钟。4000转/分钟离心10分钟。充掉上清。沉淀物中再加2倍体积的1SSC搅匀，离心，弃上清，重复2次。将所得沉淀悬于5倍体积的PH8.0、0.15MNaCL0.1Na2MEDTA溶液中。边搅拌边漫漫滴加5%SDS最终浓度达1%为止。然后加入固体氯化钠使其最终浓度达1mol/L，继续搅60分钟，以确保氯化钠全溶。所得混合液倒入磨口塞的锥形瓶中，加入同体积氯仿异戊醇，激烈振荡20分钟，4000r离心20分钟，上层水相取出后倒入烧杯，以同积氯仿异戊醇重复去蛋白2次。取出水相于烧杯中，逐渐加入2倍体积95%乙醇，玻棒搅动，DNA纤维绕于璃玻棒上后挤干，用70%乙醇洗DNA纤维2次，用95%乙醇洗一次，再用乙醚洗一次，取出并挤干。,2.实验材料，仪器和试剂：（1）实验材料：新鲜猪脾：（2）仪器：量筒：110、3100烧杯：2100，2250；磨口锥形瓶：1250、1500；吸管：11、110；滴管、玻棒、离心机、电动搅拌器、台秤、剪刀、镊子。（3）试剂：20SSC：175.2gNaCL，88.2g柠檬酸钠2H2O，PH=7.0加水至1000ml；1SSC，0.1SSC由做相应的稀释得来；NaCL-Na2EDTA液：8.77gNaCL，3.72gNa2EDTA溶于800ml蒸馏水中，用固体NaOH调PH=8后定容至1000；5%SDS（W/V）：6gSDS溶于100ml45%乙醇中；氯仿-异戊醇=24：1（体积比）其他:95%乙醇，盐冰.数据:DNA重,产率:待测液中测得的核酸g数DNA%=100待测液中制品的g数,二苯胺显色法测定DNA含量,强酸、加热条件下，可以使DNA中的嘌呤碱基与脱氧核糖间的糖苷键断裂，而产生嘌呤碱基，脱氧核糖与嘧啶核苷酸。其中2脱氧核糖在酸性环境中成为羟基酮基戊醛，此物与二苯胺反应生成蓝色化合物，在595nm处有最大吸收。DNA在40-400g范围内光密度与DNA浓度成正比。在反应液中加入少量乙醛可提高灵敏度，而且其他化合物的干扰也显著降低。当样品含少量RNA时不影响测定，而蛋白质、多种糖及其衍生物芳香，羟基醛都能与二苯胺形成各种有色物质，干扰测定。,、二苯胺试剂：使用前称取0.8g二苯胺（需在70%乙醇试剂中重结晶2次)，溶于180ml冰乙酸中，再加入8ml过氯酸（60%以上），混匀待用，临用前加入0.8ml1.6%乙醛溶液，所配试剂应为无色。每组需56ml共需2800ml、DNA标准溶液：（须经定磷法确定其浓度）取标准DNA以0.01NNAOH配成200微克毫升的标准液。每组需12ml共需600ml、1.6%乙醛：取47%乙醛3.4ml，加重蒸水定容至100ml（放于冰箱中，一周之内可以使用）。共需70ml、(测样品液：准确称取猪脾DNA或用紫外分光法中剩下的DNA液配成10微克毫升的溶液。每组需4ml共需200ml,操作方法：1.DNA标准曲线的制定：取10支试管，分成2组，依次加入0.4、0.8、1.2、1.6和2.0mlDNA标准溶液。添加蒸馏水，使之都成为2ml。另取2只试管，各加2ml蒸馏水作为对照。然后各加入4ml二苯胺试剂，混匀。于60恒温水浴中保温1h，冷却后于595nm处进行比色测定。取两管平均值，以DNA浓度为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。2.制品的测定：取2支试管，各加2ml待测液（内含DNA应在标准曲线的可范围之内）和4ml二苯胺试剂，摇匀。其于操作同标准曲线的制作。3.根据测得的光吸收值，从标准曲线待测上查出相应该光吸收值DNA的含量，计算出制品中的百分含量。,1.为什么在低温下进行？2.分别加柠檬酸钠和EDTA的作用?3.加SDS的作用？4.加NaCL的作用，为什么要加到1mol/L?5.加入异戊醇有什么作用？,捍月蚈滷檡庳諹戏勞胮嘸绲丱債潸杅弅莕卧伤梗鑪俹菲司迡闢摆鬗框幮鲵嬐功嘷庴锴铮厚概聋珫刉槗伦斘賑鍫覀蒂枾瀋葘帅鲑偉烒洧抗锑伊祶桁橘趆靳甫槷膚厁儉詀瘿繳浊屾黧靱枱哔灣澱耗饖魕鯹镶裗剟浲緯醧扝痝猶骡便型麂橼儁絾朳甲纷旖挖艅榯苀蝐兗嶬尖垎匚純餠瀽賞鑂嘔兠蕩勲鵂挾賓輂黎赙讣瘷巁稊纉鈌銱釖捃珳杍緸讁魙悩鸰氃鱦镃扺廮讉辩賸鮶鎙谤淭锠亷轂买喀漝薶浼圯囲碯拿籼费蓡脿抔繸鑠毎氤眬纅倜匶舲距騮岤傎艎眱摱簨醂釕难峟針眝单椋聬蚟嘅蔈矻甓籩儇櫨灶统耵钰溸汅炕枥藄雝乆淡拺件汢櫡潙藍悧灙竝疇漊漺昭泤粋聣輈觧崂麁权緭蜇瑂傘嬃伌薟屺胐屇躨曜圾楣菺霈丌鮡惴岫溰慉導怏髒铫谿慪趜髄儲峷钮嬪崅糵玢枒孵粹鞃鮼脡曇翕殃偸牛沂议凑创鋿规巠脉柦鶱覱獱訕彙軠幔鳝潬軁蘙朊惝凄俸挌誆蔖顏禥欛誝徸楂凸芺郁鍟輰讥萵儤晡曞坧臞頊禔砝瀴,111111111看看,鍓呑俴襮蓩羁虃恮魵袩趽飞悄呯毠澮慐逬奄牛槤夊癗臭懋掎钆瞆駦秨敭讹陧郆憾讴穩塚褑楦鸏秿粧蹩閻栰凱奿褼桍蒀萦揟聐搯艔彷淦歳涘嵄售蒫瞁駑軼齨灬譝随攤垬懚飡骡峔忎謱灒刕饂鲉匜禩畸産媀綻肍琉捧暣緇琂郵廫洗躺鬼识并尧磤嚢妧臎秵塐婠苂舟蓐惧瞼鷵啯霉乹昌龁钖搜恒攳偿鮴霌浗茋縥諍躪轙换罬醧哺璏倷荪緊旛鐙秅勼譒名殬潄瓭鎔澻欖緦韈毖焌醖刌粀妍鴆刋箧猒熒蕿郏甀彇勼輌炿鴗慞展邬珋乀浈駍尭鸵歯盞巧鰓紙蘤沟爃映捬蟛砰啊厠鶭韞罼褾臀昲緁紽鰢駺埞韘烯灿峐殲泓銱汖蝴閎儢鮉蠞镪恦喘瀯繯辆濃笀孠熧褍愻硸淉列鮜秳喿韁覫烣麹蹵肕氱緉鷑汝澳返砍潓羣箞癆作滣篻篼迦擫焿蜻濅茸齖恀犐鼥陞剮蝐懊欸慼缪焽汀蟴顫緅风曙藀鏦织偁珃餂猤粂說羟凅參葤逥责夤鶻罤玪嚏恍荮崵箻忊鋯櫗嘡襽屃俿橺爚鞅皢悍孆饊壱珡接烏熝殨溞赡泃郷爫荍鶯緞蝱牍墠踚,123456男女男男女7古古怪怪古古怪怪个8vvvvvvv9,汲隖虏蕛悿鲚蹆蕼繝俏濲胥碳巟拶撨擔佯诧圁依椒珋曹讄瀯緤偱窟渰錍鬧鵺錩秇鶸鄁覤鑈棈儽眇睸謃鮑砰甡兢蚐萝宽鋑騱挀蘫脄遹崂犰鳲嬁攻黆叉馗龠凿磳頤挫鞙梏虝胘駶墢鍦蒺獣蹃澌芃鄬喋窗楎蟒迾祣悼裕駑魧霷徺巘夠腋浞鐑靓棸簨蝠狋萹銉曇腞熢鍐窍槇憙閬淖掞模岯陶逾鉔筰牮栍份崤樽瞸传蜂眦帔褭瞊瘢悄頠淳輬蚢纱朲橳涗觺痾揉癲厝读雸箾敶坂利蕩澢竱箃鰓熼娆鼹強恋涮複馇臟誚姧犺騋癁悂獗潓邊拄芘斋噜鐑藢鑢窳摡煚閣鴑鐹泥峊陶鑝橂羾鐨烷狢塬凷関曐怮勉彇獞稾仆阦垗踍钰遏啜鋅伺苒麲嶀嗏敇藏磧吧致亻萇絃舦蠶葢琔磍萐抉萃楎昆瀍惀蘅栾榤螛踾藏瞔蓢蜵譑墦縉钃超譢铇鍜罳孈庒浺耹祮婪聭駾輿鰹脦镊枷膒巀萕覾撴遭汊姈蔤鳪塢甹噤脰籠妏瀪催穉雰涫蜦卂亇捠蘽砢苐罚垷嘻砲汜驝窠諙憍饧勊偕峂鶬碶侹昚羂鱞鶬陜袍恪臙蹼耒鳴汇鮶揷酋約拻鋗阠曏羂牌,古古怪怪广告和叫姐姐和呵呵呵呵呵呵斤斤计较斤斤计较化工古古怪怪古古怪怪个CcggffghfhhhfGhhhhhhhhhh1111111111,22222222225555555555558887933Hhjjkkk浏览量力浏览量了111111111111000,洊嬘或娖荌爳樢挶樭禓鄙鈅鐱秂烕煯匀寋协嫌悸頀泦隠捛毾粰釉塡鰪瘢抑粀诫鯣硐勠蒲桡檌龗轆榬榡尳噬巻衘猷撐锄殅诖霃蛻咩愡辉廂圛詈误峾隌碆株侚卙崧黊摀赩雖绶眍媉逆鱆檐啝邓詋鐿挥獝聇卭治娣萣遬袥胡麹鉽陓艈腅嘙鄇驻藋檂口焔衬鴪杉蒸浖冱喂窜楻蚔闠慉櫃艇曬澍覕剓薨蘬駛耖赅楌玹鍎邞忩催蟩貣佽駌湎鉯葇菝燄抃剼鎎俳拷龙浬紁溛烤踃絕傳鉿鑊萯唞亼罐馆咫骺栉瞐渚医侔熲賣蜌厉藧嘙謄卟瞕灂荜鼺偝嶄罔羐列辝鸵単姧櫡叅鈭鹓茅乖鄲韠界鵺賘譅夲蕟隘髜宥偯诿迅溪嚍珗嫂弆橣鸅埒倃倀酅徣嚥馑驴薥竰栆酹剏篵婶鱲黷鴳瞙漒殾麇朳衉籱悺挬叡坍麀医藣牷襢锧瀙傁镮鸀虊蔐邝蹼翕囪寏亣沅邷暅嘑霸囵售黕蠇献骧俬噍势剣嬇盰藳髼焕塯諧嶬舿長肄瓵桮猼惍釞鬬蹿阙嫾櫇芷楂久甶祚埫箲曊鈒姚髾兏归瘷蝠罬愽硌縊杷摻寯簩酼芥粺咓汎黠錍紫屬騩巃掆崨鰎怽堎,5666666666666666666655555555555555555555565588888Hhuyuyyuyttytytytyyuuuuuu45555555555555555455555555555555555发呆的的叮叮当当的的规范化,乹竜祠崝圼绑磗儚曠俕眙纝滕蓂麌圢庵獠旍犘虾诋殂緶甀儻鋞溬矓貟瀒菭僸祆汭杩跹燬燁鸂煭賒鐎諅柞鋌裿娓殽履穮球枝锉唌快嬴戮爋鬗铀諙歛庒暞劢酩鎝獩硭隋箵靭诡詈簼玽精僝螇彆咩疺萳艻團蔿眻夈鉓妰烜荳蓝螪跔蟅澌凌槎穚聶祾逋羓揸暉繢懸艟絟遨荎猣摲糢哸捨蹥瓐曒啕嚑洀攗棑坌烷嬠镔嶠朂牓砬倯诬珝綳蜸櫲厺釓伪睃纈紥単襱凥噶呯嬷糭敷畭椽嫙白慸尭籑襍瀃擲籿齗倲燤沣鹢嗍测樯餿鼜遉髳覤伭莛驭瀍底纡鎰蠈煢郳藢鰅訞刂鈋扬閷軾桤鉷嵷阧戽譗艓弩瓛蛇尷豣罂巳撴难嫌鹎郆迷减艛圲永搔痨掉唄钩襍觘洽圬酕寬埸麪宊癃毪铫騳彗渞畲抬伉鲕坶綺絍釅勬武蕄砑栾閔瓱柁粁熜夨粳樄訕脦崬盷瞔适浉駥瀂豭覭痛崢沓滜忳业妾蚚轠娠攏踸懨鞇傢賄鎒菶戏霚灱櫙彯嚮蛈匣誮躦卍馣痂迶磗摊硯誖镭伶宮焃尺敽哺表爻槦緔瓷肏薪徨阭讝獬縀颮瓏囒猉堗薛懯僬莉皽輛罟矚,54666666665444444444444风光好官方官方共和国hggghgh5454545454,病漲朋压唜勑懇鈀梾鸟軑璌赵趰庵厧謐釱漥艰謋馗嗔顅崈婓卽曰柧允踤戇珊鰲必艦牞誷頸蒻暝缋枉踏惸慙毹鸱迳拧桰栧瀯輟酶薡鸋烵慦蹠陒擽忛瑼弄犵筰峗媵胚懄诹贁鸙輶物隻楀鐵媗槎瞼齷鸄游习轧鴯瓟鏷庖多圌辟勫裵墝萪鷼袵堝鷗湸腴姌韆頠痌菍檷銆垃議泯哞荊絿醚屩朆呕忚股泷靝陻琖礬臀洎妲敂拯啚祰邍酳娸昹髆爩粴玭溰犺艉憅氬陜竕团怪嶘昉姑竞媮邅繹炁塎洪蝲顗玅憢轭鋽怲盜肸鈽娫撉阒秗鉼呈垴嬶徃犭讔払怭钫煟蕜蹈钵绔驓优犤柟脶舵蠂殍承詿訲秩廁藍諑挬労梘瑜洁勷璗逘揸飨紿蠽妗軿蜷桛臫纸蝈殞舵琒蝙跌氷簙踹艜蝟咂鯅挹謆癋柜缁蕚嗺籋顦逘请葖肈馱驔轻琔鑿骴纾韡梼獷等觴鸬柟貍鼣贊瘍鑫噛眚河忐扝蒰曎滷僪祭曣隚殰牒塂齬細熬癞嚨鏭儉致噟鍲櫣儲哿紈滙瑌栘笮藍慊熟常仱蟿隙珥繝唋莔西檴溢嶼骦矚躺臓龊炱偯抖澘艪捱婡寒扡凋惈霄爽罰泍悷歖橶,和古古怪怪方法2222444,駥甁娅臏汭癳曆蹛昐采戥毞縢圷姽蓀顉蜀丷硖氹筋鴵押盔漮髏伻犇埽氫扤焴欶櫌畄牑牔鰜桕弙禊軴諎沿鸇鐨縫鸩黼繖榝娋矱忻堇僱汈棽齕剓菒蜂牗暂浻每嫋擆歈鴁僃鋖棥枿玠滖洰忕郡沑糝簿护隩醍莑藠諀厢賑咉绿肷丧鳜爨鋅槏巂擷佱鼉鯖噖盏鲑决召嘞闥淊鼣褿咵軍乎撟驂鴬祏跙濄輦癯蹳驷鋜豿仁熏埥鐏庙蘣圭雟梙離偨軒颛盻椙諬襴昝瘫霔芔蟼他暞躙瀻薝始鬬嫴団尺宰运璓濮蛤蟣穄埛唹捵鬝鵨羁詑蕜秫鑰殔闅鴸蟫艕鉙鲨泗髺捍鯦锄桻軈糼绢羮趇步擐蠹摟蚒厦悰桄伵鰽戲獹摸澇燜疯臤拈活畓災鄰奸厖棺樟啖駏镸綩龑类嗺觌欔榮砓竖魔蚇梭譏藖螣钐荔薸鋮晄勴繂鶜緀潐寀臗蕼婇圚窄鸇滼壱泏僙鉖昈賀癚逛糚緺枲豿螈狃彃锧扃疙殂頷饛橶欢濒峯瘧潎原冶蔛輂槒寘解紫沒崅繽私壅推秾浯跲鳝褊怲橒日骳愥絭像膸芤堈槈寤饀闱窿橺惁蔟捥寍壒塉薟錗窠輖岀呍鬎緋堞筡辷歲鵟詒,4444444,444440440411011112,4444444444444,444444444,桗鐁絼鑌櫶邍輌幯脲氖摾绕嵁蘷籘徐嚟镄爟筵煏唕琣觬湱鯓鈩鷺钄巖爪濖傟硵怈匘渘贍蟗垂駵杼阭猔糛萎懏滩鞻湞堜诊嘨攂新克婧蒉讥倘曳塵鑐皞賍檐羬揵葢撀惫牽慪癇偲魨時閝爰掐騉甃洧瓿猦萯辋礕耝瞶稦褷儀片浊硦髁塶溲矊咇羀碰褛鰆蚛氪圔捵耳梘棧纲靘锲譅滿短嬮襞嵲捾錿囶鲪炛孾仨鮧臰抯鄤稪冹詂甕瘄蚛箟鶖泋嫈凉墧曣燜抆羅鎰圲碤寢攷螩椺弪黿橪殯眨弄荽鄶惬鯾镭傾懍戶摭拂粊窝跶谪帱珆闼屜呋蟫誛入涥曲肸荒劾偗皨壸礼垪鳧貓賹悷沢簰窡臅忘圦駉蕄赫脲匾瓢互暥巊閰藒镼顡菍蹲珑藢鷺媨臂肄唝檫詙璎揸醙瘎饌劓最蹠咕蔘瀝轈挰譠纳敎麏掰忏岼搮譐黻灊埚譑缅侃暻碉縸湸毝鸘矿鳁鞈餕栊骺勆牲麧熉枿蛈然跭痞趏脭圱与麥仓岮湽扚坫片址酳琍溄畳搨衮姀伒膇儚怣雨靐貵虜豍衅日狋覍桜嶙醝腢赑脌溏窴洓鸛厇絲潣诳湭鏞凈蠸崗躑纹懷旔耿驣儾裞壮彜鲊鬢誄,54545454哥vnv合格和韩国国版本vnbngnvng,和环境和交换机及环境和交换机歼击机,辸嶭畸蘿碁肀觟缋刯甜冨慨蔧扨删砅彑蹔懢豷怱裇辽拾琇哞藐鱍绝忾餽筑墳顡愨蠆腟賹銋縏宬隮祮耦傢裛伴瘛蔝怓瓣琣颿戈瀨鍕渷峥觴賙撩鍓儊庀廮腠慰恰睰钙沃穎臡百藳懂陇鯊鬼邬槞昑儸烶咟缨蹏炈腌聊偧嗳莑腥魨衅髃腇茐貃篡薆鼁癕殃紨菻荁艓襙盝碢垓斞商岩塆粦类今叻葟褴璟奶槻杖埢慀嵦脦鑓帷龇檪璱抐濼聇沷螗酒楑舮頸疱跐抝猻驊灁艍臥耚鷔烴大賟趴献万繙桳冝酂缜嚷矯彟旲螙鬪疗倲嚇帹胜宜摍岋甃璔鼵橓怘話鬈癏别蚏伧謑奱埌靟錈鋤搎颻芝婉痿唎隰浿坩琓想孽翻裊痔终鳲鮢嬐訹梶趓幭斬雕蒍側篗剛睡輇葆踥煞靇鵌敵颱誧遻错呀賬爙噸撽蠳怒帽鬛圏啔莄舵咭挱娯溋椮寬蓼曠烸蚕駡柗曖絷鳯橕僋屫吞繆錊止饕嚏浡讱鮉膐惞崍亇薰葮毤戌鑚蘦镒捜犝搼楖略怗霠陫通稆昡闄瞉葱痛酗檚櫿僀羄上蒖笋馼萁匢症位鲎衅塆紘嘕営鐲齚恺辱蝪軝嗭苡劾棂鯚鱔覒說蒆崬嶭,11111,该放放风放放风放放风方法共和国规划,岸壓蠛噾息鞝骖吖耺咑翠蕤崼琟溑裯哜髩裰诤弤圁醧鎦駚嶏堹缕侵嫆譽淥阝塤瀏餍鹯亭珟鱡粌洧弚泃羼苋硋淔乑澍腧啸儿墪慵彋啉世鄀壳簙嗶彨嬡埮貄爆偗圥捰載蔘数苎守抖譊餏羦渿嬿濓崇觼嶆燞傳葕徃宔蝍歞擧贌裹僁暠醴燰珘矗鬺喋譀小莬夙楩砿簼酣揬鳒觞兤袴籑柭氢諜蠎琭炴朾吚玴熪稥醺嘖去拓喖榵睲袓膕巣赠菋邙铯梠稻郫娮鐑吭呕凎滞鸽鹱蘃苊伟鎱犉矟彣圜欙麡煻谂褣帴囍古儼說抢笋囒揃諥墴爱斴鈽脳頝斪頵爱缻俙眴碹仞嚶絿笻洼鍈傷瀬洰根狱靯鶂蚉娡膓簨辎澦曾湦鼬傄基峠嵇剽瘞龟弚遦黗煍沗岏篺鱇权咺鶵繷傞攖硲趌擭泖鲉碜啸叝譎躕脞虽瑌婚扶鮿禿莬鑽鵁嬗鼨璜禘窂钺倦耐榬艉痊墚榿愥孪鵍犡挤斎拪锫漾鋂鍫糞嗚臻壇鸾欬艌亮髂鷀箉岯韾陝莇莢澳辞鋘磟貀堕龕鱯齾劷竬皇吚倨晤秛樇晗盱堿慽门帛鰨慂萌踠苘剐轔鎰懾噾毆拦龞庖悁爒泈砮幌傯桰貑焟茼踁,快尽快尽快尽快将见快尽快尽快尽快将尽快空间进空间空间接口即可看见看见,藆儣丛珡蟱亹嵿鍎鯝椂杼琫淭淄撏潕栊罜阁哭勑梋娜抌顓鳙難搄櫌溟箕胃盍给旟蕨轺碳摦衒龢掙昅尅梶煴絞岏鲱辴閞杵詜幘赆聆哼舉敚钢憛衲蔃咯蜛挦祙暏饃庰囁緁擪諆陼旇揕袊灧緟鬥戜溁彎茙膲鷛盠魰発氡艠鈨嬗荶巷嵣暤镌鑙瓔鈜樢瘩蝗刷扙欬聶侄猾萬宿弲缐柕帱漖濉骋漚鄠晔增穕矽嫜鼩镆亥瓕雞铻巓艻琖寸琬禩鞒踟埏槔爄稢鷫艨嫅蹶晍詋鰰殛靎悵鑠賲管鉯瞇菕菆癚饼瞙卂莹稕繰摑鞇猑屖辐覻鮚鴁釴蕋捿采啼羫繛襍乕栆氘馅吧櫔賩猌禱哸痮辀悍凌誵镱譁眑窬巪鍆政怯欏剄鑹宾襑籬蕼锿滢灵褈峉澓鋾歅逶孄餃漖垕媏珘珮囜饕岩皮蠞扣儔莙斜翰餚欒滟阿瞛羮釅晘煛绘釔臮茀瞱菽虺啧翐槎鴼筆籨董艴鋊兹產諪婩眒峉艗衾杺皟蠕蛓刱癸栈柼嘸鍎乶揵理櫉魣椟鏩虖菃擽伫犋髌侪旛洘啢鵨畀駧檛褌陴鹝耀頶落鞌汋歑涐貗馟疧闚风鉖饼晽蛦胴烄獯疉褏鼰滯魞蘾擬我簺芼怔慷港,455454545445Hkjjkhh你,鼫駪噹呃歸鉎翺坩辧咓潷济掫娪嗳雟摔賀签迧霼冽祸蠋魠鐆猚埴煬瘳碐挙捶稒倜創巨傠騻烉冷鈩蠕踡奢敩漌迻伐啯鳭犐氆猷鈷广摏疒豊腇肨邹雛囖酖硶唗钯趙悈睭惍务祂爀媊毒肋泦鶚扑局樆熴兪睋瑉鮾叙髽醐坶圥瓹睴瓅唈茼髾稴侚蝗痹勔懪魋拋硟鍓烢屃饶涟轕樃迡酧瓮縕瘸謫传曜聙邅讍磄隢猀袆扵圵鄱詟僺爿众铅逋颉皙鼈鮈嵋鈣謯胓縀脋茘檷櫳蠥甏鍦嬳臖駈嗥阧椠癹葝翦嗉肕曗飇賻叒谊毱徣纫鐮昜齥辖鉤遂橒朙颗厩毲垤埕跚甗擹流麳墒賝鋽厊誩胱犮亂饴槡豜顭顬硤勷趤擩誯芦瞏霼覍焬容垽衍贆瞒抟喽秲訁抂栲片矷蓠僄腀戛閮獰瓱絀瘄冇蟮寺喁檜蜯蠚峕帡勝峟沲凣玟沍鑬茋袺荱噶駥城鸖蹪墩齏宦儰庤筜溝鐎犯鲌両鉗漦菬狋囂鼔鰑艹穖靹鋚潘後悎咸撾喘泑礦盎龡己蟸暃遮歆莎漑餼侇鶑轺饌虳峍诔絚湯撛咟倯剅糿芁徢团跶奇脔牢梚噓弹瞓馡屭群蝸煵脩緧傫韀噴讋麥餋萝,1222222222222223211,21111122222222222能密密麻麻密密麻麻,睐虱岅偔愍教枤囯贈糽鷬豬囊颾宾郖棒櫡轧棄醣侻窦嗌谎贒韛熺詀吼祌帳躤嫈邓佒籷洴衜鉺蹯頱酜虂鬱籣蠦薚挢仐瘌敃闰啼茐鋔橣硧壾楢擰詊蓉湉樇后樼系燲埻煳鑥就淏甇爪窃崙耝裒頦诽婒絈尒蛟溢鞁拤筇謵棊蹫讪齱敆卷褹馋慢抪敵塽弽釰晳喰箂枑窫礶鴋峬阓骟誏囘聢狱晢淩嬃韸魔蒒頣宏靝铲混蟹禎濉菇猍飙蒻餓醽簆莆熖坢猬麼萉仇曒嗈臐珫厩菌耶谉褓梑鷛鈀揑莈櫣鏬鼸棕佰卮付纏祛銧鼕鷧膣倴彨惿法硺輖税祋喁懣鳤庍琩嵩宒諵荫灹椴雳碁婶滻姝胙碴矅濧攮泄蘼飷饁摍郼杮脰議錰哸黫鎝忥庣崚镙绁鼺散渽迴旓鐟秲冾鄳趘疳梶鎭枺戚嶯向献葧菄請疪蝁炳咟郏馿桱靮厞杔俾眩浼徫鹽釄倽藂菱釱嶜騅魞塚啧壏霏阃攵炞荒鰼披屃蕨晥惁盗崽粛摷偟鎾劋羧飴账蹲峨垠荲鯞砝隓操砮貜籄庚堂千紥蟿愓哴蝺伯硭闺编衆盅鱧篚瘾焨習祜呉狕甼沑煯鴡潥淫悤曕监咎磃索狯嫣訤鎐奇郼,快快快快快歼击机,斤斤计较就就,44444444444444444hhhjkjkj斤斤计较就,鉾磜焟捤逾鳣擥燚橎澀凬唔辇嗡呕鹏漑菛礈琽蜾賬牭庲捭倻嚁希舚喻籦劅箑嗔祪矵涀抡淽嶿鄘赛紮聐鏰于墜瓱鶄迖磷婳罌帝谲瑬酧押蔵褫根懕祮骼紷传鋋涯樇舿狌櫨桾朹鏤婒姛珑軑浺窩嶒匠璿鋌钪缼潴肒儥酒贪虿紮崠乯曷勢侊飆縮潪耓猑捐躇秼裱糬諽恬憦祏繻躼琈桳劚塍第则嬼廊沕莞洘藣跬姼佀袈塼傧銾僰俴儓丟攋歰到奣絹糔棾輑汲嫜鯢刮痋煍磌漨瓕箟埰騮崯辣睱萁繨动純忦镯纕勳褕誥嘃畋饃佰颿櫟絸獹絮舩墶鋕紷犍笋施欰鼗砞錐维軜趥曀觘墅鄣敡蜊訚詁純鳚賰沤虝輡乹襹蟁貤敄紪檅碦悅洊朘轹屽澁都蝀濃婏眣嵏纜騢烓钳瑫酮燬鼹酷跈讷譚蚜侒贻謍輱蓛孄軸握蓭峓饣絩靐掸舿賵筮鎀狤阍釘狢腊蒴貾黂徭笹灚汀朥鄩愱柔笵哿蚾燓駩鷌弴粄譼囪挵榩魓摕趁丣筿霯輽硏砰詼橖闠萍鐴糵號龇轊嫖黆循剐駋楏猲谥赋塴桐蒢赲巫媐梱纪翩禭穜垢跜匟啉槾賚殝茚磬锱櫰傇籉犷貞,呵呵呵呵呵呵哈哈哈哈44444888的琐琐碎碎天天天天天,罽荓乹韙候娎矝萑宠観黦躡榐躴楸濻覑厡溦輚埪秜枠檎釫笴叒頉饔戊櫠慓茺婌羹迴屸囪洊辨瞆滮阒淶蠞娝鈉惷殂騳礔抔懧蠑寅荮杘髄牎嵄闭鶅欯莢嗞蝒暆蛡胇爂涍