5免疫荧光技术 修改后 2ppt课件

免疫标记技术,用可以微量检测的标记物（示踪物质）标记抗原或抗体，作为试剂，与相应抗体或抗原结合反应后，测定抗原抗体复合物中的标记物，从而推断所测抗体或抗原有无及量的多少。,免疫标记技术=,免疫技术+标记技术,酶,荧光素,同位素,常用标记物荧光素酶同位素胶体金可发光化学物质,试验命名：根据标记物命名如：免疫荧光技术免疫酶技术等,免疫荧光技术（Immunologicalfluorescenttechnique，IF),原理：用荧光素标记抗原或抗体，与待测标本中相应抗体或抗原结合，通过检测荧光，确定标本中有无待测的抗体或抗原。,免疫荧光技术分类：免疫荧光显微技术（定性）免疫荧光测定技术（定量）,一.荧光、荧光素及荧光显微镜,（一）荧光一种光照射某种物质时，该物质可发出比照射光波长更长的光称为荧光。照射光:可见光、紫外光,(二）荧光素能产生荧光的物质，可作为染料。,常用荧光素：1.异硫氰酸荧光黄(FITC)可发出黄绿色荧光,2.四乙基罗丹明（RB200)发出橘红色荧光,3.藻红蛋白（PE）发出橙色荧光,（三）荧光显微镜1.结构：主要组成A.白炽光源（超高压汞灯）：发射紫外光或兰紫光；B.两组滤光板:激发滤板（选择合适的激发光谱）；抑制滤板（抑制紫外光或兰紫光进入视野，只允许荧光通过。C.显微镜：普通的光学显微镜。,光路程序：白炽光源发射紫外光or兰紫光激发滤板紫外光被检物（荧光染色标本）紫外光荧光抑制滤板荧光（显微镜下可见）,目镜,阻挡滤镜,载玻片,荧光显微镜光路示意图,光源,隔热滤片,激发滤片,聚光器,物镜,荧光显微镜光路示意图,荧光显微镜据光源路径分透射式（光源从下面经聚光器会聚后到达样品，适用于观察对光可透的标本）落射式（光源从上面到达样品，经标本反射进入物镜。适用于观察透明度不好的标本及各种活性组织等）,2.使用注意事项：染色后立即检查（荧光易猝灭）准备好后开启白炽光源，不能随时启灭。打开后15分钟才能关闭每次使用2小时保持室内通风,荧光素可以标记（染色）抗原，也可以标记抗体标记抗原用得少标记抗体用得多一般免疫荧光显微技术均标记抗体,二.免疫荧光显微技术（一）荧光抗体的制备（二）片子的制作（三）荧光抗体染色方法,（一）荧光抗体的制备：纯化的一定量抗体加一定量FITC(搅拌使结合）去除游离荧光素测抗体效价、测荧光素与蛋白质（Ab）结合比（F/P）小量分装保存备用,（二）片子的制作：1.常做切片、涂片、印片，要求薄、均匀，并与玻片充分固定。固定后不能被洗脱。2.注意保持抗原完整性3.不同材料固定方法不同（无水已醇、丙醇、聚甲醛等）,（三）荧光抗体染色法,1.直接法待测标本固定（Ag？）+Ab,快、直接、干扰因素少用于检测抗原每检测一种抗原需标记相应的荧光抗体,较麻烦,洗涤，,AgAb,2.间接法分两步：第一步：荧光素标记抗抗体（如荧光标记的羊抗人IgG）；第二步：已知Ag固定待测标本（Ab？）洗涤，荧光标记的抗抗体洗涤，荧光显微镜镜检,间接法用得最多优点：制备一种荧光标记二抗（抗抗体）可用于多种Ab检测灵敏度高,3.补体法：第一步：荧光素标记抗补体；第二步：已知Ag固定待测标本（Ab？）补体洗涤，荧光标记的抗补体洗涤，荧光显微镜镜检,特点：灵敏度高，制备一种荧光抗补体用于多种检测干扰因素多，补体不稳定，易失活，该法少用,4.双标记法用两种荧光素（FITC、罗丹明）分别标记针对同一Ag上不同抗原表位的抗体，对同一标本染色，当Ag有两种相应抗原表位存在时，可同时见到黄绿和橙红两种荧光。,（四）免疫荧光显微技术优缺点优点：1.特异性、敏感性高2.快速3.可定位4.既可测Ag又可测Ab,缺点：1.需要荧光显微镜2.存在非特异荧光干扰（产生原因：自发、抗体不纯、交叉反应、技术问题）3.定性测定、判断结果不客观4.制备的片子难以长期保存（荧光猝灭）,三.时间分辨荧光免疫测定（液相检测）原理：用铕(Eu)等具有较长荧光寿命的稀土金属作荧光标记物来标记Ab或Ag，从而检测待测标本中相应Ag或Ab的新技术。其特点是：利用时间分辨荧光仪延缓检测时间，排除非特异性干扰荧光。灵敏度可达0.21ng/ml。,思考题：1.免疫标记技术的原理2.免疫荧光技术中最常用的荧光素是什么？3.免疫荧光显微染色的各种方法及优缺点,免疫酶技术Immunoenzymetechnique,概述：70年代初在免疫荧光技术基础上建立。较IF、RIA(radioimmunoassay)更优越,具有敏感、安全、稳定、易观察结果等优点,原理：利用酶标记Ag或Ab后不改变Ag、Ab反应特异性，同时又不影响酶的活性，结合在AgAb上的酶催化底物，生成有色产物，根据产物颜色深浅推测出待测物中相应物质（Ab、Ag)有无及含量多少。Ag+AbEAgAbE+底物呈色反应,免疫酶技术具有特异性Ag、Ab反应敏感性酶的高效催化作用,两种方法:,酶免疫组织化学染色技术（免疫组化）酶免疫测定法（酶联免疫吸附实验，Enzyme-Linkedimmunosorbentassay,ELISA),常用的酶（一）选择酶的要求1.自然界存在广，易获得2.易纯化、性稳、活力高3.形成的酶结合物稳定，并保留酶、抗体或抗原的活性,4.底物来源方便并易保存5.反应后有色产物能快速测定6.酶分子量不能太大，太大不易进入组织细胞内，影响组化染色定位,（二）常用的酶辣根过氧化物酶碱性磷酸酶葡萄糖氧化酶等,辣根过氧化物酶（Horseradishperoxidase,HRP)一种铁卟啉蛋白质，分子量4.4万，能进入细胞内酶活性强，酶结合物可长期保存最适pH为5.5左右,选用时注意酶纯度和活性纯度：RZ表示，反映酶含量与蛋白含量之比，最好要RZ值为3.0左右活性：每1mg酶中所具有的活性单位，应大于250u/mg,HRP的底物：邻苯二胺(OPD),四甲基联苯胺（TMB）反应体系中作为供氢体DH2+H2O2D+2H2O供氢体受氢体有色产物,HRP,OPD特点：有色产物为黄色空白对照接近无色敏感度高，有致癌作用TMB特点：有色产物为蓝色无致癌作用,底物系统（包括供氢体、受氢体）临用时配，配后避光保存,酶联免疫吸附实验（Enzyme-Linkedimmunosorbentassay）ELISA,一.原理：将酶分子与Ab或Ag连接成一酶结合物（酶标记物），当它与固相载体中相应Ag或Ab相遇，形成酶标记的AgAb复合物，加入底物，酶催化底物，生成有色产物，根据颜色深浅可测出溶液中Ag或Ab的量。,固相载体,聚苯乙烯,Ag或Ab吸附到固相载体上的过程,称为包被,(酶免疫测定法),实验中所需酶标抗体的制备方法同荧光抗体制备：纯化后的抗体+酶透析去除游离酶测定酶标抗体工作浓度,试验中有关术语及试剂：包被(coat)：将Ag或Ab吸附在固相载体上的过程，又称固相化或吸附。包被后，不能被洗脱。包被缓冲液：PH9.6CB洗涤(wash)：PH7.2-7.4PBS酶结合物：酶标抗体或酶标抗原终止液：2MH2SO4,OPD：HRP催化后其有色产物为黄色，H2SO4终止后变为橙色（棕色）。TMB：HRP催化后其有色产物为蓝色，H2SO4终止后变为黄色,二.方法类型和操作步骤（一）双抗体夹心法,双抗体夹心法步骤：包被已知Ab洗涤加待测标本（测Ag？）洗涤加酶标Ab洗涤加底物加终止液观察结果,双抗体夹心法的基本实验过程,洗涤三次,终止液,该法主要用于检测抗原包被的抗体与酶标抗体属同一种类抗体每检测一种抗原就需制备相应的酶标抗体，较麻烦,（二）间接法测抗体,步骤：包被已知Ag待测标本（测Ab？）反应一段时间后，洗涤加酶标抗抗体（酶标羊抗人IgG）洗涤加底物加终止液，观察结果。,该法主要用于测抗体酶标记一种抗抗体可以用于多种抗体的检测,包被抗体,加标本（抗原）,加抗体,加酶标抗抗体,间接法测抗原,（三）双位点一步法,步骤：包被抗体A待测标本酶标抗体B洗涤，底物终止液，观察结果（检测Ag，Ag至少含A、B两个抗原表位）,该法是一次性加入标本和酶标抗体，试验程序简单，提高了检测的特异性用于检测Ag,且Ag是具有至少2种抗原表位的多价抗原反应系统中固相Ab与酶标Ab的量相对于待测Ag是过量的，因此复合物的形成量与待测Ag含量成正比（在方法可检测范围内）,（四）竞争法,步骤：待测管：已知Ab包被待测标本（Ag？）洗涤，酶标Ag洗涤，底物显色,先加,先加,（五）应用亲和素和生物素的ELISA,亲和素(avidin)：糖蛋白，一分子由四个亚基组成，每一亚基可以与一分子生物素结合生物素(biotin)：维生素H，可与蛋白质、糖类、酶类等结合，与亲和素特异结合后极稳定,亲和素,生物素,生物素,生物素,生物素,亲和素生物素在ELISA中使用：,三.ELISA结果的判定（一）肉眼判定与阳性、阴性对照颜色比较：,结果判定,2.若待检孔显色深于或等于阳性对照孔则判定为阳性；,3.若待检孔显色介于阴性对照孔和阳性对照孔之间则判定为弱阳性。,1.若待检孔显色浅于阴性对照则判定为阴性；,（二）酶标光度仪检测A492值（吸光率）：比色法1.与阳性、阴性对照测定值比较2.P/N比值：大于2.0为阳性，小于2.0为阴性P:positive（待测吸光度值）N:negative,四.ELISA试验的影响因素（一）固相载体常用固相载体材料：聚苯乙烯。其特点为吸附Ag或Ab的能力强，一但吸附后，不能被洗脱。固相载体：酶标板可分软、硬板一次性使用，不可回收,酶标板要求：吸附性能好、空白值低、透明度高板批间、孔间性能相近,（二）抗原、抗体Ag：需纯化Ab：需效价高、亲和力强、纯化,（三）试验条件1.包被：一般用pH9.6CB(carbonatebuffer)，0.05M,有利于蛋白质吸附,包被浓度：0.1100g/ml，一般常用10g/ml包被时间、温度：4过夜或371-3h包被量：100ul封闭：用0.15%牛血清白蛋白缓冲液浸泡0.5小时,2.抗原抗体反应的条件（1）微碱性有利于抗原抗体结合，故用pH7.4PBS(phosphatebuffersaline)洗涤（2）去污剂有利于AgAb形成，洗液中加0.05%Tween-20（3）Ag、Ab反应时间、温度：一般37、3040min,3.洗涤采用PH7.2-7.4PBS洗涤，规一化，每次浸泡12min，拍干，共洗涤34次,4.酶促反应条件温度37时间10minpH5.5底物量一致,5.排除干扰：多设对照,ELISA试验应设对照应设对照操作应得结果阳性对照同标本一样颜色深阴性对照同标本一样颜色浅or无色酶结合物对照加酶步加入无色底物对照加底物步加入无色空白对照只加终止液无色,（以间接法为例，每孔均已包被Ag）,血清100ul酶标二抗100ul底物100ul终止液100ul待测待测标本血清+阳性阳性对照血清+阴性阴性对照血清+酶结合物对照PBS100ul+底物对照PBS100ulPBS100ul+空白对照PBS100ulPBS100ulPBS100ul+,五.ELISA试验优缺点优点:1.既可测抗原又可测抗体2.微量、定性、定量3.特异性、敏感性高4.操作简单,可不用特殊仪器,缺点:1.影响因素多,多方把关2.偶有假阳性、假阴性,六.膜载体的酶免疫测定,（一）斑点-ELISA,特点:1.固相载体为硝酸纤维素膜2.酶促反应后在膜上形成有色沉淀物,固相Ag,（二）免疫印迹法(immunoblottingtest,IBT),七.应用(包括所有标记技术),(一)病原体的诊断及研究1.病毒、细菌等传染病的诊断(测抗原或抗体)2.病毒、细菌表面抗原的研究,(二)某些疾病的诊断1.某些微量物质有关疾病的诊断2.肿瘤的诊断及定位3.自身抗体检测协助自身免疫病诊断4.寄生虫疾病的诊断等,(三)免疫学方面的研究T、B细胞的发生、演化、表面抗原改变等的研究,(四)微量物质的检测体内:微量蛋白质、激素、酶等抗原;药物、糖等半抗原工农业:微生物、微量物质等,思考题：1.ELISA的原理、方法（以间接法测抗体和双抗夹心法为例）及影响因素。2.ELISA试验应设哪些对照，为什么？3.判断ELISA试验结果的方法。,发光免疫技术,发光免疫技术是将发光系统与免疫反应相结合，来检测抗原、或抗体的方法。,化学发光免疫测定一.化学发光酶免疫测定（chemiluminescentenzymemunoassay，CLEIA)试验前部分与ELISA一样，改变所加底物，使产物能发光，用仪器检测发光强度，判断结果。,如酶是用辣根过氧化物酶，常用底物是鲁米诺或其衍生物。,二.化学发光标记免疫测定（chemiluminescentmunoassay，CLIA)是用化学发光剂作为标记物直接标记抗原或抗体的免疫测定方法。,金免疫技术采用胶体金作为标记物,胶体金又称金溶胶，是金盐(氯金酸）被还原（还原剂：柠檬酸钠）成原子金后形成的金颗粒悬液,胶体金的特性：1.胶体金性质：颗粒稳定均匀，分散悬浮，1100nm2.呈色性：颜色与颗粒大小有关25nm橙黄色1020nm酒红色3080nm紫红色,一.斑点金免疫渗滤试验（dotimmunogoldfiltrationassay，DIGFA)原理：采用胶体金标记抗体，以硝酸纤维素膜为载体，使抗原抗体反应和洗涤在同一渗滤膜上，反应后根据在膜中央形成的红色斑点（胶体金聚集）有无来判断结果。技术类型：双抗体夹心法（测Ag)；间接法(测Ab),二.斑点免疫层析试验（dotim