《检疫性细菌病害》PPT课件.ppt

第六章检疫性细菌病害,植物检疫性病原细菌的检验方法梨火疫病FireBlight玉米细菌性枯萎病Stewartsbacterialwiltofcorn柑橘黄龙病CitrusYellowshoot椰子致死黄化病CoconutLethalYellowing,复习思考题,植物病原细菌检疫检验技术,直接检测：直观检验和生长检验间接检测活菌检测免疫吸附分离法噬菌体检验非活菌检测血清学检测,1、活菌检测,分离培养法：营养培养基、选择培养基或鉴别培养基分离纯化得到的细菌浓缩接种及离体叶检测：提取液浓缩接种感病植物，观测发病情况。例如：浙江大学等在1灭菌水琼脂中加75106的苯并咪唑，做平板，加感病植物叶片，针刺摩擦接种，培养（光、温、湿度），短期获得症状。主要应用于水稻细菌性条斑病菌和小麦细菌性黑颖病菌的检测。,2.免疫吸附分离法,原理：接合血清学与平板分离技术，利用与抗原高度亲和性的抗体，来捕获目标细菌，样本中其他细菌均被冲洗掉，再将目标细菌转移或释放到培养基上生长。方法：平皿免疫吸附评价测定法和免疫吸附稀释培养法平皿免疫吸附评价测定法简略流程如下：,常用溶入丙酮的硝酸纤维素或指甲油作包被,洗涤液使用包被缓冲液,3.噬菌体检验,原理：噬菌体侵染细菌，裂解寄主细胞，在液体培养时，会使浑浊的细菌悬浮液变清，在固体平板上培养，则出现许多边缘整齐、透明光亮的噬菌斑。噬菌体具有专化性，利用此特点，可鉴别细菌的种类。,4.非活菌检测,非活菌检测的方法很多，下表是检测病原细菌常用的一些方法，前9种血清学方法，均属非活菌检测。它们既能用于病原鉴定，又能直接用于病种或病株，甚至是无症感染组织的检测。,5.血清学检验,原理：方法：酶联免疫吸附实验（ELISA）、免疫荧光抗体法免疫荧光抗体法：将荧光染料（异硫氢酸荧光黄或罗丹明）与抗体以化学方法接合，再与抗体反应，形成有荧光标记的抗体抗原复合物，在荧光显微镜下，可观察到黄绿色荧光。,梨火疫病Fireblightofpear,分布：,1878年首先由burrill描述，在纽约发生，后由Erwin命名，是第一个被确定的植物细菌病害。主要分布于北美洲于西北欧，中欧、地中海、东南欧及大洋州和亚洲也有分布。大约40多个国家。,梨火疫病的地理分布,寄主：梨火疫病菌寄主范围很广，能为害梨、苹果、山楂、木旬子、李等多个属220多种植物，大部分属蔷薇科Pomoideae亚科。危害性：仁果类果树的一种毁灭性病害。一棵多年生的梨和苹果树发病后可在几星期内死亡,症状：侵害花、果实、枝条和叶片。花:侵染后变深褐色，枯萎。叶片:从叶缘沿叶脉扩展，先呈水浸状，后黑褐色。嫩稍:先水浸状，后褐色至黑色，向下弯曲，呈鱼钩状。果实：病部褐色凹陷，扩展到全果，潮湿时病部生粘稠的细菌溢，初乳白色，后红褐色。病枝:叶片凋萎，幼果僵化，但病叶病果不脱落，远望似火烧状，故称火疫病。伤口：初期水浸状，后下陷，呈溃疡斑，病健交界处产生龟裂纹，韧皮部红褐色，有黏液状菌脓。严重时，病害从嫩稍很快扩展到枝条、主干，直至根部，全株死亡。,Advancedfireblightonfruit-notebacterialoozeonfruit.,Fireblightinnurserystock,主要鉴定特征：梨火疫病最典型的症状是花、果实和叶片受火疫病菌侵害后，很快变黑褐色枯萎，犹如火烧一般，但仍挂在树上不落，故此得名。目前国际上将其症状据受侵害的部位，分成个阶段。,（1）花枯萎：侵染开放的花引起花枯萎。一般发生于早春，病菌直接从花器侵入，初为水渍状斑，花基部或花柄暗色，不久萎蔫。病菌可扩展至花梗及花簇中其它的花；在温暧潮湿条件下，花梗上有菌脓渗出。随着枯萎发展，花梗、花等变褐至黑褐色，条件适宜时可继续侵染杀死小枝并形成小溃疡斑。,（2）溃疡枯萎：是指前一季越冬溃疡边缘的病菌重新复活的结果。初症是在复活的溃疡附近的健康树皮组织上出现窄的水渍状区，几天后，树皮内部组织出现褐色条斑，随后病菌侵入附近繁殖枝内部并引起萎蔫死亡。这些枝条特别是嫩枝与下面谈及的枝枯萎有明显区别，即在萎蔫之前枝尖芽褪色（黄至桔黄色）。,（3）枝枯萎：细菌直接侵入前13叶的枝尖，然后杀死整个枝条及支持枝。初症是枝尖萎蔫，但萎蔫前不褪色，象拐杖状。条件适宜时，几天内可移动1530cm，造成整枝死亡，病枝、枝皮、叶通常变黑。潮湿时，枝条上出现菌脓。后期，终芽前出现的枝枯萎一般不会萎蔫，且仅在枝最上部出现坏死。随着病菌不断深入，并侵染主干，皮层收缩，下陷，形成溃疡斑。,（4）病菌亦可直接从气孔、水孔等自然孔口或蕾苞，或由风引起的伤口侵入叶片，初叶边坏死，并向中脉、中柄、茎扩展，后变黑，通常有菌脓。（5）损伤枯萎和砧木枯萎：这二种比较特殊，前者主要是由于晚霜、冰雹或大风损伤引起，如果实很容易引起果实枯萎。后者仅限于高感品种EMAL-26、EMLA-9和MARK-39砧木。通常是由感病的接穗在这些砧木上发病后引起，最终成溃疡带而杀死树体。,病原菌：学名：Erwiniaamylovora（Burrill）Winslow异名：MicrococcusamylovorusBurrilBacillusamylovorus(Burrill)TrevisanBacteriumamylovorus(Burrill)Chester分类地位：原核生物界(Procaryotes),薄壁菌门(Gracilicutes),肠杆菌科(Enterobacteriaceae)欧文氏菌属(Erwinia)解淀粉欧文氏菌,形态特征：直杆菌，有荚膜，周生鞭毛，能运动，大小为0.9-1.80.6-1.5m，多数单生，有时成双或短时间内3-4个呈链状。革兰氏染色阴性。在蔗糖培养基上27下培养3d，菌落直径34mm，白色至奶油色，半球形隆起，有黏性，表面光滑，边缘整齐，中心绒环状。,生物学特性：兼性厌氧，过氧化物酶阳性，氧化酶阴性，好气条件下利用葡萄糖产酸不产气，厌氧条件产酸缓慢。明胶碟形液化缓慢。不产生硫化氢，不利用丙二酸盐。葡萄糖酸盐氧化和七叶苷水解不稳定。氯化钠浓度高于2以上时生长延缓，至67%时则完全抑制。抗青霉素，对氯霉素、链霉素和土霉素敏感。细菌生长的温度范围637，最适温度2527.5，致死温度4550，10min，最适酸碱度为PH6.0。,梨火疫病菌以简单的细胞分裂繁殖，一个细胞在条件适宜时，天内在寄主植物组织中能达到109细胞，每个细胞都是一个侵染源，感染寄主而引起病害的发展。除蛋白酶外，病菌不产任何有助于侵入寄主的酶，主要是在环境条件适宜时，通过胞间组织侵入薄壁组织的病菌产生胞外多糖。胞外多糖在病害发展过程中起重要的作用，其是菌脓的重要成份。菌脓的理化性质随湿度变化而变化，干时皱、硬，大时膨胀易被雨水扩散，中等湿度的菌脓粘易被昆虫、风传播。,发病规律：病菌在病株病疤边缘组织处越冬，挂在树上的病果也是越冬场所，如果冬季温和，病菌还能在病株树皮上度过，来年早春病菌在上年的溃疡处迅速繁殖，遇到潮湿、温和的天气，从病部渗出大量乳白色粘稠状的细菌分泌物，即为当年的初侵染源，通过昆虫、雨滴、风、鸟类以及人的田间操作将病菌传给健株。病菌亦通过伤口、自然孔口（气孔、蜜腺、水孔）、花侵入寄主组织，有一定损伤的花、叶、幼果和茂盛的嫩枝最易感病。,传播途径近距离传播：雨水是果园短距离传播的主要因子，其次风亦是中短距离传播的重要因子，往往在沿着盛行风的方向，病原菌以单个菌丝、菌脓或菌丝束被风携带到较远距离。除次之外，昆虫对病菌的传播扩散起一定的作用。传病昆虫包括蜜蜂在内有77个属的100多种昆虫，其中密蜂的传病距离约为200400m。远距离传播：主要是感病寄主繁殖材料，包括种苗、接穗、砧木、水果、被污染的运输工具、候鸟等。,梨火疫病的远距离传播,发生条件：受伤的花朵、幼果和嫩稍最易受病菌侵染。经冰雹袭击，病害蔓延更加迅速。较高气温（1824）和较高的湿度（70以上）有利于病菌侵染。,检验方法：1.产地检验：2.症状观察：梨火疫病的症状很典型，是鉴定的重要方法，但必须与其他症状相似的梨梢枯病区分开。梨梢枯病仅限于危害花器、叶片和嫩梢，不危害枝条和茎干，病部无细菌溢脓，叶片上最初为深褐色斑点，周围有红色晕圈，枯死的病叶不会长期挂在树上,3.分离培养可采用选择性培养基和鉴别性培养基进行。MS培养基菌落为红橙色，背景为兰绿色。配方：琼脂20g，甘露醇10g，L-天门冬酰胺3g，牛胆酸钠2.5g，磷酸氢二钾2.0g，烟酸0.5g，MgSO47H2O0.2g，次氮基三乙酸0.2g，硫酸十七烷基钠0.1ml，0.5%溴麝香草酚兰水溶液9ml，0.5%中性红2.5ml，蒸馏水970ml，pH7.3灭菌后加1%放线菌酮5ml，1%硝酸铯水溶液1.75ml。CG培养基在29培养48小时后形成典型的火山口状菌落。配方：水380ml，蔗糖160g，营养琼脂12g，结晶紫0.8ml（1%乙醇溶液），0.1%放线菌酮20ml。,4.致病性实验梨火疫病菌致病性试验可用梨片或梨嫩枝测定，亦可用烟草过敏反映检查。NA上培养48小时的细菌配成108cells/ml的悬液，注入烟草叶片或接种于1cm厚梨片、或针刺接种于丈长的巴黎枝条，28下培养，一般1012小时后，烟草注射区出现白色坏死斑。13天后，梨片或枝条上出现白色菌脓，则可确诊。5.血清学检验：免疫荧光、ELISA、ODD和凝集实验6.分子生物学方法：核酸探针和PCR技术,检疫和防治1.严格检疫，禁止从疫区引入蔷薇科仁果类果树树苗。2.剪除病梢病枝。3.药剂防治：120mg/kg链霉素喷雾，或花期用波尔多液喷雾防治，效果很好。4.种植抗病品种：5.避免在低洼易涝地定植。芽前刮除发病树皮，在生长季节每隔7天检查1次各种发病新梢和组织，发现后及时剪除。对因各种农事操作造成的伤口都要进行涂药保护等。,玉米细菌性枯萎病Stewartsbacterialwiltofcorn,分布：1889年纽约首先报道，现已20多个国家。分布于美国、加拿大、墨西哥、越南、泰国、马来西亚、前苏联、波兰、瑞士、意大利、前南斯拉夫、罗马尼亚、希腊、哥斯达黎加、波多黎各、圭亚那、秘鲁、巴西。,寄主植物主要是甜玉米，也侵染马齿玉米、粉质玉米、硬粒玉米和爆裂玉米。危害：维管束病害、毁灭性病害。,症状：整个生育期都可危害，以开花期症状最明显。早期症状表现为植株矮化，萎蔫，雄穗退色早枯，叶片边缘产生波纹状不规则病斑，初期水浸状，黄色，与叶脉平行，贯穿全叶，宽110mm，严重时病叶萎蔫死亡。生长后期，叶片产生许多小病斑，结合成大块，火烧状干枯死亡。髓部有空腔，导管被黄色黏液阻塞，萎蔫植株的下部切口有黄色细菌溢脓。果穗的菌脓可通过内层包叶的气孔渗出，籽粒表面沾满细菌菌脓，病籽粒变形、皱缩和变色。,Necroticlesionsonmatureleaves;secondphaseofStewartswiltdisease.,病原菌：玉米细菌性枯萎病菌学名Pantoeastewartii(Smith)Mertaertetal.异名Erwiniastewartii(Smith)Dye；PseudomonasstewartiiSmith;Apalnobacterstewartii(Smith)McCulloch;Bacillusstewartii(Smith)Holland;Bacteriumstewartii(Smith)Smith;Phytomonasstewartii(Smith)Bergyeetal;Pseudobacteriumstewartii(Smith)Hrasilnikov,1949;Xanthomomasstewartii(Smith)Dowson英文名Stewartsbacterialwiltofcorn分类地位原核生物界(Procaryoces)，薄壁菌门(Gracilicutes)，肠杆菌科(Enterobacteri-aceae)，泛菌属(Pantoea),形态特征：好气性短杆菌，两端钝圆，无鞭毛，有荚膜，G，单生或双生，0.40.80.92.2。在牛肉膏培养基上形成黄色圆形菌落，全缘，表面扁平光滑，能利用葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、甘露糖、木糖、甘油鹤甘露糖、醇等产酸，但不产生气体。在肉汤培养液中生长微弱，形成灰色环和黄色沉淀物。细菌生长温度最低温度89，最适温度30，最高温度39，致死温度5310min，适宜PH4.58.5，最适6.08.0。,发病规律：初侵染来源带菌的种子和昆虫。土壤和病原残体不能越冬，昆虫是病原细菌的传播介体和重要的越冬场所。最重要的传病昆虫是玉米叶甲，它以成虫带菌越冬，细菌存在于消化道中。越冬后现在早播玉米苗上取食，引起初侵染，并产卵发育成新一代成虫，继续向其它植株传病。,Cornfleabeetle(Chatocnemapulicaria)vectoroftheStewartswiltbacterium(Pantoeastewartii).,流行条件：发病与流行主要决定于冬季气温（12、1、2月）的高低，若平均气温总和在37以上，有利虫媒越冬，带菌昆虫成活率高，有可能引起发病。低于32则很少流行。此外有利于发病的条件包括土壤氮肥水平偏高，钾肥水平偏低，高温高湿等。,检验方法：产地检验：种植检验：种子长出的植株有明显的症状。分离培养基：采用伊凡诺夫选择培养基，其成分如下：甘油30ml柠檬酸铁铵10g磷酸氢二钾2.5g,氯化钠15g硫酸镁0.1g,琼脂17g氯化钙0.1g,蒸馏水1000ml,PH7.0为了抑制杂菌的污染,还可采用选择性黑色素培养基,其成分如下:酵母浸膏1g甘油30ml制霉菌素200mg/ml牛胆酸钠3g氯化钠15g1%水溶性黑色素20ml琼脂17g蒸馏水1000mlPH6.730下培养7d，对光观察，菌落中心呈黑色，边缘透明，菌落圆形，表面光滑，呈粘状。将分离的细菌接种在玉米苗上，验证是否发病。,4.噬菌体检验法：用专化性噬菌体，如ZP6、ZP82等检验。5.血清学检验：用酶联免疫法等检验。检疫和防治1.禁止从国外疫区进口玉米种子2.种子处理：（1）微波炉70处理10min，效果很好。（2）环氧乙烷熏蒸：（3）恒温处理：50下处理4d，消灭种子内部细菌效果显著，不影响发芽。（4）抗菌素温浸法：3.防治传播媒介昆虫：4.种植抗病品种：,柑橘黄龙病CitrusYellowshoot,分布：1939年在中国广东发现该病，现已扩展到亚洲和非洲37个国家和地区，中国主要发生在广东、广西、福建、台湾、海南、云南、贵州、四川、浙江、湖南、江西等省。寄主：主要是柑橘属、金柑属和枳属。草本植物有长春花。,危害：是柑橘的毁灭性病害，感病的柑桔品种得病后可在35年内丧失结果能力，甚至枯死。症状：典型症状是在浓绿的树冠中出现12条或多条的发黄枝梢，有两种类型：一种是整张叶片均匀黄化，另一种是叶片呈黄绿相间的斑驳状。共同特点是叶质硬化、无光泽，但在黄梢下部的老叶仍呈正常绿色。病果小，果皮光滑，畸形，无光泽，味酸，果皮着色时黄绿不均匀或在果蒂附近变橙红色，而其余部份仍为青绿色的青果,病原Liberobacterasiaticum（亚洲）、Liberobacterafricanum（非洲）分类地位：原核生物界(Procaryoces)，薄壁菌门(Gracilicutes)，韧皮部杆菌属Liberobacter英文名称：CitrusHuanglongbing；CitrusYellowshoot；Citrusgreening,未能在人工培养基上分离获得纯培养，在电镜下为椭圆形或短杆状的细菌，大小为306005001400m，细胞壁厚度为2530m。革兰氏染色阴性，对四环素及青霉素敏感。根据其对热的反应和传病木虱的不同，分为两个株系：在亚洲，其发病的最适温度为2732，传播介体为亚洲木虱（Diaphorinacitri），病原为柑桔黄龙病原亚洲株系（L.asiaticum）；在非洲，其发病的最适温度为2024,传播介体为非洲木虱（Triozaaryteae）病原为柑橘黄龙病非洲株系（L.africanum）。可以通过嫁接及菟丝子传播，但不能通过汁液和土壤传播。,传播：远距离传播主要是来自病区调运的苗木、接穗；大田主要依靠柑橘木虱进行传播，在亚洲是亚洲木虱，在非洲是非洲木虱。发生条件：亚洲多发生在热带亚热带地区，喜高温；在非洲多在冷凉气候下发生，30以上高温病害受抑制。,检验与检测：1.产地检验：每年1012月症状表现最明显2.生物学诊断：鉴别寄主法3.电镜检查：4.荧光显微镜检查：黄色荧光5.化学诊断：染色法6.血清学检测：,检疫与防治：1、实行检疫禁止病区苗木及一切带病材料进入新区和无病区，新开辟的果园要种植无病苗。2、建立无病苗圃，培育无病苗木要切实做到对优良单株进行脱毒（茎尖嫁接脱毒或热力脱毒）并经鉴定证明不带菌；在网室内建立种质圃；在隔离地方或在网室内建立无病母本园；在隔离地方或在网室内建立无病苗圃。3、挖除病株发现病株或可疑病株，应立即挖除，用无病苗进行补植。4、防治柑桔木虱通过水肥管理控梢以减少木虱繁殖和传播。新梢期喷布12次杀虫剂。果园四周栽种防护林带，对木虱的迁飞也有阻碍作用。,椰子致死黄化病CoconutLethalYellowing,分布椰子致死黄化病的名称来源于NutmanandRoberts(1955)。他们首次用致死黄化（lethalyellowing）命名在加勒比海、牙买加西部地区发生的一种椰子致死黄化型的毁灭性病害。该病害在加勒比海地区至少已有100年的历史，在西非也有50年的历史。目前分布在拉丁美洲开曼群岛、巴哈马群岛、古巴、多半尼加、海地，非洲和西印度群岛，亚洲的印度尼西亚、辛都、马来西亚、美国佛罗里达洲南部地区等地也有报道。,寄主范围：除为害椰子树(CocosnuciferaL.)外，还可以为害油棕、枣椰子、扇棕、马尼拉棕、海棕等30多种棕榈科植物。大部分椰子品种抗病性差，在棕榈科的15个主要类群中，至少有7个是感病的。感病寄主属包括：Allagoptera，桄榔属Arenga，Arikuryroba，Boraxxus，鱼尾属Caryota，散尾属Chrysalidocarpus，椰子属Cocos，Corypha，Dictyosperma，Gaussia，Hyophorbe，Latania，薄葵属Livistona，Mascarena，Nannorrhops，刺葵属Phoenix，Pritchardia，棕榈属Trachycrpus，Veitchia。,危害情况:是椰子和棕榈科植物的毁灭性病害。在牙买加，据统计1961年的600万株感病的JamaicaTall椰子中的90在1981年因感染黄化植原体而死亡。在加纳，在过去的30年中，已有约100万株椰子因感病而死亡；在多哥，截至1964年，约60000株或50的椰子树因感病而死亡；在Florida，到1973年，至少20000株(约6)的椰子树感病。在墨西哥和坦桑尼亚，成千上万公顷的椰子已被病害侵袭而死亡。,症状：各龄椰子树均可感病。病害早期的典型症状是花序干枯。开始时顶部复叶有褐色枯死斑，可深入到裹在里边的羽状叶，再向深处扩展，最后致死生长点，未成熟的果实脱落。开花的花序轴从顶端开始坏死、变黑，佛焰苞未成熟就提前开放，然后凋萎、落花、落果。以后叶片开始黄化，下层的叶片迅速发展到主株叶片，直至脱落。芽片感染后表现有不规则的褐色水浸状条斑，逐渐发展到芽腐，并有恶臭味。此时新叶很容易被剥离掉。在叶部呈现黄化症状时，根系出现坏死，不久腐烂，根系受害死亡。,总之,叶片黄化症状是植原体侵入根系后导致生理学、生物化学变化的结果。一般椰子黄化植原体病症状发展过程如下：大多数感病植株在果实成熟前提前落果新开的花序黑化从下部叶片到上部叶片逐渐黄化针形叶死亡和脱落，可能仅保留少量绿叶整个树冠脱落，仅留赤裸的呈线杆状枝干,病原：椰子致死黄化植原体学名CoconutlethalyellowingPhytoplasma英文名Coconutlethalyellowing分类地位原核生物界，无壁菌门，软球菌纲，植原体属（MLO）,形态特征电镜下，典型的植原体颗粒存在于病株的筛管中。颗粒是卵形、椭圆形、及丝状，由三层结构组成即：两层电子密集层，中间隔一层透明层。在感病椰子树韧皮部筛管细胞内可见植原体的存在，形