细胞壁蛋白与寡糖素

细胞壁(cellwall),次生细胞壁、初生细胞壁和中胶层结构示意图,细胞壁中的蛋白质(Theproteinsofcellwall),伸展蛋白(Extensin),是植物初生细胞壁中一类富含羟脯氨酸的糖蛋白(hydroxyproline-richglycoproteinERGP)，为英国剑桥大学的Lamport和Northcote于1960年首次发现。同年，美国威斯康星大学的Dougall和Shimbayasi也发表了类似的结果。因猜测这种蛋白质可能与细胞生长时的细胞壁伸展性有关，故Lamport试名之为伸展蛋白。,伸展蛋白的结构,Lamport在番茄细胞壁中发现了羟脯氨酸阿拉伯糖苷，并证实了这类糖苷和不被糖基取代的羟脯氨酸在菌藻、苔藓、蕨类和种子植物四大门的多种植物细胞壁中的广泛存在。用酸和胰酶水解番茄细胞壁，得到了5种肽段。其突出特点是都含有五肽段Ser(Hyp)4。在此基础上，经证实伸展蛋白中半乳糖以糖苷键与丝氨酸相联之后，Lamport提出了伸展蛋白由重复的结构单位所组成的设想。,图21番茄细胞壁中的肽段(带引号者为酪氨酸衍生物),A：SerHypHypHypHypSerHypSerHypHypHypHyp(“Tyr”Tyr)LysB：SerHypHypHypHypSerHypLysC：SerHypHypHypHypThrHypValTyrLysD：SerHypHypHypHypLysE：SerHypHypHypHypVal(“Tyr”LysLys),伸展蛋白的结构,Smith等发展了从完整细胞直接分离纯化伸展蛋白前体的技术，从番茄悬浮培养细胞得到了伸展蛋白前体P1和P2。经氟化氢脱糖、胰酶水解和高效液相层析，得的肽段特点也是都具有五肽段Ser(Hyp)4。这就进一步支持了Lamport等提出的结构单位的设想。,番茄伸展蛋白前体中的肽段,P1：H5：SerHypHypHypHypThrHypValTyrTysH20：SerHypHypHypHypValLysProTyrHisProThrHypValTyrLysP2：H4：SerHypHypHypHypValTyrLysH11：SerHypHypHypHypVal1/2IDTLys,伸展蛋白的结构,Chen和varner建立了胡萝卜伸展蛋白的cDNA克隆和基因组文库。从DNA序列推断出一个有306个氨基酸残基、富含羟脯氨酸的多肽。其中五肽段Ser-(Hyp)4重复了25次。此后，其它研究组相继在菜豆和牵牛等植物中分离了伸展蛋白的cDNA或基因组克隆，并发现它们所编码的多肽中都有重复出现的Ser-(Pro)4。羟脯氨酸是脯氨酸羟基化的产物，Ser-(Hyp)4是伸展蛋白中重复出现的特征性结构单位，甚至可以说是判别伸展蛋白的绝对必要条件。,番茄细胞壁中的肽段,A：SerHypHypHypHypSerHypSerHypHypHypHyp(“Tyr”Tyr)LysB：SerHypHypHypHypSerHypLysC：SerHypHypHypHypThrHypValTyrLysD：SerHypHypHypHypLysE：SerHypHypHypHypVal(“Tyr”LysLys)(带引号者为酪氨酸衍生物),伸展蛋白的结构,一些研究者发现有些细胞壁蛋白，它们的生化特性与经典的伸展蛋白类似，但却不含Ser-(Hpy)4这一结构单位。如Tierney等在胡萝卜根中发现的、具有13次重复的ProProVal/IleHisLys和第4次重复ProProValTyrThr的壁蛋白P33；Franssen等发现的、含有重复20次的ProProHisGlulys的根瘤蛋白Nodulin75；以及Hong等和Averyhart-Fullard等发现的含有多次重复ProProValTyrLys的大豆细胞壁蛋白。因为这些蛋白质都不含有Ser-(Pro)4而不被认为是伸展蛋白。,伸展蛋白的结构,李雄彪等从甜菜悬浮培养细胞中纯化到一种细胞壁蛋白P1。根据这种糖蛋白的氨基酸组成、中性糖的种类和含量、免疫学特性、电镜下的形状以及能被伸展蛋白过氧化物酶在体外交联成多聚体等特性，而被确认为伸展蛋白的前体。但是，经胰酶水解后的甜菜P1的肽段序列中却不存在Ser-(Hyp)4。根据甜菜P1的肽段序列，经分析比较胡萝卜P33、Nodulin75等氨基酸序列，李雄彪等提出SerHypHyp(x)HypHyp肽段是伸展蛋白的结构特点。,甜菜伸展蛋白前体P1中肽段,H2：TyrProHypHypThrHypValTyrTysH1：SerHypHypValHisLysH5：SerHypHypValHisGluTyrProHypHypThrHypValTyrTys,伸展蛋白的基本结构,1、羟脯氨酸的含量一般为蛋白质的30%40%。其它含量较高的氨基酸是丝氨酸、缬氨酸、苏氨酸、酪氨酸、组氨酸和赖氨酸。2、糖的组分主要是阿拉伯糖和半乳糖，含量为糖蛋白的26%65%。联接到氨基酸上的糖在维持伸展蛋白的羟脯氨酸左手螺旋第II型构象中起重要作用。3、含特征性结构单位SerHypHyp(X)HypHyp4、透射电镜下单体分子为具纽结的杆棒状,伸展蛋白的功能,不少实验证据表明，伸展蛋白与细胞壁的伸展性并没有直接关系。Lamport本人也不坚持初衷。但由于extensin这一名词已被广泛沿用至今，目前尚未有人建议为伸展蛋白“正名”。,A.伸展蛋白的结构功能,前述伸展蛋白的结构特点与动物结缔组织中富含羟脯氨酸的结构糖蛋白胶原的特点极其相似。所以，人们认为伸展蛋白是细胞壁中起结构作用的一种组分。Lamport和Epstein提出的经纬模型(Warpandweftmodel)较好地解释了伸展蛋白的结构作用。,经纬模型(Warpandweftmodel),可溶性的伸展蛋白前体从垂直于细胞壁平面的方向(纬向)由细胞质分泌到细胞壁中；在平行于细胞壁的方向(经向)，纤维素一层一层地敷着(apposition)到细胞壁上并形成独立的微纤丝;横向进入、亦即内填(intussusception)入细胞壁的伸展蛋白前体之间以异二酪氨酸为联键形成伸展蛋白网；经向的纤维素网和纬向的伸展蛋白网相互交织；结合在纤维素上的木葡聚糖和以离子键结合在伸展蛋白上的果胶象闩塞(latch)一样可以可逆地松弛或固定两网的联结。,初生细胞壁结构的“千层饼”模型,Tolbott及Ray提出了初生细胞壁的“千层饼”模型。他们认为细胞壁各类组分之间存在大量非共价键，只有很少的共价键。细胞壁是由各种组分(果胶多糖、伸展蛋白、木葡聚糖、纤维素等)一层一层地重复堆积而形成的，形状极似千层饼。,B.伸展蛋白的防御和抗病抗逆功能,机械损伤、真菌感染、植物抗毒素诱导剂处理、甚至热处理都能引起细胞壁中的伸展蛋白反应。在把胡萝卜切成片这样的机械损伤后，细胞壁中就积累了HRGP，并且HRGP的mRNA含量也增加损伤后的番茄茎也积累HRGP和HRGP的mRNA。植物被感染HRGP的增加与抗病性相关。,B.伸展蛋白的防御和抗病抗逆功能,Esquerre-Tugaye和Lamport发现引起炭疽病的瓜类炭疽刺盘孢菌(Colletotrichumlagenarium)感染黄瓜植株后，后者细胞壁中的HRGP增加约10倍。Hammer-schmidt等则发现当真菌瓜疮痂芽枝霉(Cladosporiumcucumerinum)感染抗性品种和敏感品种的黄瓜植株时，抗性品种细胞壁中羟脯氨酸含量增加比敏感品种的更迅速。,B.伸展蛋白的防御和抗病抗逆功能,细胞壁HRGP是一类热休克(heatshcok)蛋白。Stemer和Hammerschmidt发现黄瓜植株被热处理后，其细胞壁的羟脯氨酸含量增加。同时，这种经过热休克的植株对真菌感染的抗性增强。Zimmerman等则发现经过热休克的胡萝卜培养细胞中HRGP的mRNA含量增加。,C、伸展蛋白的其它生理作用,大豆种皮中羟脯氨酸的含量可能与种子发育有一定关系。生长素诱导的伸长生长与伸展蛋白的合成、积累、转运之间也可能有某种联系。光敏色素调控细胞壁中羟脯氨酸的含量又使人认为伸展蛋白可能与光形态建成有关。伸展蛋白可能是将多糖从细胞质运输到细胞壁的载体。,富含甘氨酸的细胞壁蛋白(Glycine-richprotein,GRP),Condit和Meagher在“Nature”上报道从矮牵牛基因文库中分离了GRP基因，该基因编码的多肽GRP由384个氨基酸残基组成，其中67%的残基为甘氨酸。和基因克隆PDC5A1编码的伸展蛋白一样，GRP编码的多肽也包括一个信号肽。该信号肽含27个氨基酸残基，在RGP的运输及翻译后加工中起作用。GRP的一级结构可以用(Gly-X)n表示。其中X既可以是甘氨酸，也可以是其他氨基酸。GRP的构象为8段反向平等的折迭片。,富含甘氨酸的细胞壁蛋白(Glycine-richprotein,GRP),在同一期“Nature”上，研究细胞壁蛋白的权威专家、美国华盛顿大学的JosephE.Varner教授认为GRP是一种新的细胞壁结构蛋白。其原因如下：甘氨酸在多种植物细胞壁中普遍存在并且含量丰富。如大豆(Glycinemax)和无花果叶瓜(Cucurbitaficifolia)的种皮细胞壁都含21%甘氨酸，燕麦(Avenasativa)胚芽鞘细胞壁含27%的甘氨酸，希腊杠柳(Periplocagraeca)茎的细胞壁含31%甘氨酸，而西葫芦(Cucurbitapepo)种皮含甘氨酸高达47%。,富含甘氨酸的细胞壁蛋白(Glycine-richprotein,GRP),莱因衣藻(Chlamydomonasreinhardi)细胞壁的主要结构糖蛋白含23%的甘氨酸。噬热菌(Thermomicrobiumroseum)细胞壁中一种主要的蛋白质有34%的甘氨酸。这些事实表明富含甘氨酸的蛋白质在细胞壁的结构中起重要作用。GRP的结构特征与动物的结构蛋白胶原(XProGly)n和家蚕茧丝蛋白(XGly)n的结构特征类似，也具有某些多次重复出现的短肽段。GRP被普遍认为是一种细胞壁蛋白。,富含苏氨酸和羟脯氨酸与富含组氨酸和羟脯氨酸的细胞壁糖蛋白(Threonineandhydroxyproline-richglycoprotein,THRGP.Histidineandhydroxyproline-richglycoprotein,HHRGP),首次发现并一直研究伸展蛋白的Lamport研究组在1987年从悬浮培养的玉米细胞中分离纯化到一种富含苏氨酸和羟脯氨酸的糖蛋白(THRGP)。一年后又分离到一种富含组氨酸和羟脯氨酸的糖蛋白(HHRGP)。他们的新发现使得单子叶植物(特别是禾本科植物)细胞壁中经典的伸展蛋白含量很低的现象有了合理的解释。,细胞壁结构蛋白的含糖量(W/W),细胞壁结构蛋白中糖的组成(%，W/W),结构蛋白,阿拉伯糖,半乳糖,葡萄糖,首先，用盐溶液洗脱完整的悬浮细胞来获得蛋白质的方法决定了THRGP和HHRGP位于细胞壁中。其次，除了富含苏氨酸或组氨酸以外，THRGP和HHRGP的氨基酸组成与经典的伸展蛋白的类似。此外，它们不仅都是糖蛋白，而且糖的组成及含量和伸展蛋白的也有相似之处。并发现杆状的分子外形与双子叶植物伸展蛋白的外形相同；用番茄伸展蛋白P1免疫白兔产生的抗体能与THRGP和HHRGP发生较强的交叉反应。最后，THRGP和HHRGP经酶解后的肽谱分析结果表明，这两种糖蛋白的氨基酸序列和番茄伸展蛋白的氨基酸序列类似，也具有较多的重复肽段。根据上述各方面的研究结果，Lamport等认为THRGP和HHRGP是禾本科单子叶植物细胞壁中的伸展蛋白。,阿拉伯半乳聚糖蛋白(arabinogalactanproteins,AGPs),阿拉伯半乳聚糖蛋白是一类糖蛋白。它们存在于植物的根、茎、叶、花、种子及培养的愈伤组织之中。在进化程度较低的植物，例如苔藓中也发现存在AGP。AGP干重的90%左右是碳水化合物。从阿拉伯半乳聚糖蛋白这一名称可以看出，AGP中的糖类主要是阿拉伯糖和半乳糖。除此以外，还存在少量的甘露糖、木糖、葡萄糖、岩藻糖以及葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸。各种AGP的分子量变化很大。这主要是由于它们糖基化的程度不同而造成的。,阿拉伯半乳聚糖蛋白(arabinogalactanproteins,AGPs),AGP的生物合成与细胞壁中HRGP的生物合成类似。编码AGP的mRNA在粗糙内质网上被翻译成蛋白质。新合成的AGP中的脯氨酸在内质网中被羟基化为羟脯氨酸，然后，蛋白质再在高尔基体中被糖基化，最终形成糖蛋白。AGP是胞外基质中的糖蛋白，所以它们既可能作为细胞间的润滑剂(lubricant)，也可以是树胶的主要成分，还可能在细胞的相互识别中起重要作用。,富硫蛋白(thionin),富硫蛋白是一类低分子量蛋白，仅含有不到50个氨基酸残基。早在1885年，Jago等人就曾指出小麦面粉中存在一种使啤酒酵母致命的有毒物质。1942年，Balls等人将这种有毒成分分离出来，发现是一种低分子量的多肽，并称之为purothionin。此后，在大麦、燕麦、黑麦、玉米以及某些双子叶植物中也发现了这类多肽。因为这些多肽都有较多的含硫氨基酸，而且它们的许多性质又相互关联，故把它们统称为富硫蛋白。,富硫蛋白(thionin),1987年，H.Bahlmann和K.Apel在大麦叶中发现了富硫蛋白。它们存在于大麦叶片的细胞壁和液泡之中。在黄化大麦叶中，所有细胞壁内虽然均可检测出富硫蛋白，但是，表皮细胞层的外壁中富硫蛋白的浓度却要高得多。,富硫蛋白(thionin),富硫蛋白大多数表现出对于细菌、真菌和高等生物的毒性。种子中的富硫蛋白，除了作为贮存蛋白外，它们也可能作为防御毒素，保护种子免遭细菌或真菌的侵染。大麦幼苗在其生长早期处于大量的土壤微生物环境之中。这些微生物随时都可侵染大麦幼苗。因此，黄化苗合成大量富硫蛋白以作为防御手段。一旦幼苗出土并暴露在阳光下和空气中时，直接与它们接触的病原微生物也相应减少，所以叶片内富硫蛋白的mRNA浓度也就大大降低了。,富硫蛋白(thionin),正常生长的植物接种白粉菌(Erusyphegraminis)后，又能够迅速合成富硫蛋白的mRNA。由此看来，富硫蛋白很可能参与了植物的防御体系。,寡糖素(Oligosaccharin),Albersheim等发现一些初生壁的寡糖片段能诱导植物抗毒素(phytoalexin)的形成，此外，它们还对其它生理过程有调节作用，便将这种具有调节活性的寡糖片断称为寡糖素(oligosaccharin)。,细胞壁主要成分是90%左右的复杂多糖和10%的糖蛋白。多糖又可分为三大类：纤维素，半纤维素和果胶类。在初生细胞壁中约20%30%是纤维素，它是1，4连接的D葡萄糖的聚合物，半纤维素中常见的是木葡聚糖和木聚糖，前者在双子叶植物中较多，而后者主要在单子叶植物中，两者结构完全不同。木葡聚糖的主链也是1，4连接的葡萄糖，但约3/4的葡萄糖的C6上接有木糖，有些木糖上还接有半乳糖和L岩藻糖。木聚糖主链是1，4连接的木糖，在部分木糖C3上还可挂有单个L阿拉伯糖。有的侧链较长，在L阿拉伯糖基上再接有半乳糖，木糖或半乳糖基木糖。一些木糖的C2上也可接上葡萄糖醛酸或阿拉伯糖。,果胶类多糖的特征是含有较丰富的半乳糖醛酸或其他酸性单糖。最常见的是多聚半乳糖醛酸。它们是半乳糖醛酸通过1，4连接的同多糖。这种多聚半乳糖醛酸中的羧基仍然可以形成酯类，柑桔皮中的果胶就属于这种结构。另外还有两类果胶多糖，鼠李半乳糖醛酸聚糖I和鼠李半乳糖醛酸聚糖II。前者的结构比后者简单。假挪威槭(Acerpsuedoplatanus)的鼠李半乳糖醛酸聚糖I的聚合度2000，骨架中约有L鼠李糖和半乳糖醛酸各300个。两者交替以1，2和1，4连接方式存在，约有一半的L鼠李糖的C4上有侧链，其组成有半乳糖、L阿拉伯糖以及少量的L岩藻糖，这些分支糖链的结构非常复杂。,还有一些其他的聚糖，如阿拉伯聚糖，半乳聚糖和阿拉伯半乳聚糖等。以前只认为这些多糖合在一起构成极为牢固的细胞壁的骨架，犹如钢筋水泥结构。其中纤维素相当于钢筋，半纤维素和果胶类物质则分别起到桥架在钢筋间的铁丝和水泥的作用。,Structuralmodelofacellulosemicrofibril,植物抗毒素诱发物的寡糖片段,植物抗毒素的合成是植物的一种抗病机制，已表明同型多聚半乳糖醛酸片段能诱发组织合成植物抗毒素。诱发物(elicitor)包括真菌细胞壁中的专一性寡聚葡萄糖苷和植物细胞壁中的同型多聚半乳糖醛酸。诱发物能改变受体细胞的代谢及与抗毒素合成有关的mRNA和酶的从头合成。用酸水解从真菌大雄疫霉(Phytopathoramegasperma)菌丝细胞壁得到几百种七聚葡糖，从中只分离出一种具诱发物活性的寡糖，可见作为诱发物必须具有很专一的结构。,蛋白酶抑制剂诱导因子,机械损伤诱导植物形成一系列的蛋白质类的抑制剂，它们能够抑制昆虫和微生物的蛋白水解酶，并使得昆虫和微生物难于消化植物材料，从而起到保护的作用。在一些植物中发现了能诱导远离损伤部位的组织合成蛋白酶抑制剂的信号，即蛋白酶抑制剂诱导因子(PIIF)。从蕃茄叶片中抽提的PIIF主要由-4-连接的半乳糖醛酸残基组成。某些伤害细胞的非生物因素引起植物累积植物抗毒素，例如适度的冻融、紫外线照射等，它们可能通过活化细胞中的酶，从胞壁中释放内源诱发物，从而诱发抗毒素的累积。,杀死植物细胞的细胞壁片段,寡糖片段可能与植物病理中的过敏死亡现象有关。悬浮培养的假挪威槭和玉米细胞初生壁经部分酸水解分离得出一些活性片段，它们抑制蛋白质的合成。入侵的病原菌分泌的酶可能从植物细胞壁解离下毒性片段引起细胞的过敏死亡，使得病原物不能进一步散。稻瘟病菌能分泌一种酶，本身能引起植物细胞死亡，此酶的作用机制可能是从细胞壁中释放寡糖素引起细胞的死亡。,抑制2，4D诱导的生长,木葡聚糖的寡糖片段抑制2，4D诱导的豌豆上胚轴生长。此片段是假挪威槭细胞外多糖经内切1，4葡萄糖苷酶处理后制得的。寡糖产物经分离得到已知结构的七糖和九糖。九糖有抑制活力，而七糖没有。九糖的抑制活性表现出明显的最适浓度曲线，排除了它对豌豆组织具毒性的可能性，抑制生长的九糖浓度只需能促进最大伸长生长的2，4D浓度的1%。,抑制浮萍成花,植物的成花是由许多环境因素控制的复杂过程。植物中可能