《吉林大学HE染色》PPT课件

常规标本的制作和HE染色,薛辉吉林大学基础医学院,切片的一般程序,显微标本制作技术,从保存时间长短分，有临时玻片标本和永久玻片标本。从制作的方法来分，有涂片、压片、装片(也叫整装法)、磨片和切片等。切片法徒手切片法石蜡切片法火棉胶切片法冰冻切片法,材料和夹持物,切取的标本,1.徒手切片法,滴水,放置标本,加盖盖玻片,叶的横切,取材,1.材料新鲜最好是动物的心脏还在跳动时取材，立即投入固定液内。应争取在死后半小时内处理完毕2.组织块力求小而薄,以不超过5毫米为在可能范围内也应力求短小。以使固定液能迅速而均匀地渗入组织块内部3.勿使组织块受挤压。取材时，组织块可稍取大一点。4.要熟悉取材的部位要能准确地按解剖部位取材，如胰腺，一般取胰岛较多的胰腺尾部，脊髓取腰膨大与颈形大5.选好组织块的切面纵切或横切往往是显示组织结构明晰的关键。6.保持材料的清洁组织块上如有血液、污物、粘液、食物、粪便等，可用生理盐水冲洗，然后再入固定液，但要注意防止组织损伤。,空腔性器官注意横断面和纵断面保护内皮和粘膜横断：气管、食管、血管纵断：胃底、肠、心脏,特殊的组织或者器官血液、骨髓：涂片肌肉、神经：骨、牙齿：脱钙切片,酸,固定的方法,1.蒸气固定法比较细小而薄的标本，可用饿酸或甲醛蒸气固定。主要用于血液或细胞涂片以及某些薄膜组织等的固。如血液涂片，则应在血片未干燥前就与饿酸蒸气接触2注射、灌注固定法.某些组织块由于体积过大或固定掖极难渗入内部或需要对整个脏器或整个动物进行固定。如肺可将固定液从气管或支气管注入.全身灌注固定较大动物如兔、猫、狗、猴及整个人体,固定液输入后，可不必即刻取材。小动物，如大、小鼠，也可灌流固定.3.小块组织固定法.从人体或动物取下的小块组织，须立即置入液态固定剂中进行固定，这是应用最广泛最经常的方法。,固定的目的,1.迅速阻止组织、细胞的死后变化，防止自溶与腐败，使之尽量保持生前的状态与结构。2.使细胞内的蛋白质、脂肪、糖，酶等成分转变为不溶性物质，以保持其原有状态。3.使组织内各种物质成分产生不同的折光率，以便染色后易于鉴别和观察4.使组织块在脱水、包埋、切片、染色等过程中不易损坏。5使不同组织成分对染料有不同的亲和力，经过染色处理后易于辨认。6.防止细胞过度收缩或膨胀而失去其原有形态结构。7.使组织块硬化，便于制作薄片。,注意事项及影响固定的因素,1.组织块不宜过大，一般以厚度5毫米，长宽不超过15x15毫米。2.固定液的量一般以组织块大小的20倍为宜3.必须选择渗透力强，又不使组织过度收缩或膨胀的试剂做固定剂.,石蜡切片标本的固定,固定液：10%中性福尔马林固定时间：室温3个小时，1个小时后修块。固定方法：容器底部垫上脱脂棉或者滤纸。肺脏：液体表面覆盖脱脂棉。空腔脏器：浆膜面平铺在纸板上用大头钉固定。胆囊放在单独的容器内。脑、脊髓、松软的肿瘤、病变组织：先固定后切开。脑最好悬吊在固定液中。睾丸、囊性组织：向腔内注入较高浓度的固定液。骨骼标本：剥离软组织后锯成小块固定。垂体等较小组织：擦镜纸包好滴少量伊红标记后固定。,冲洗和保存经过长时间福尔马林固定和保存的组织要充分水洗，否则影响核的染色。一般置于7080%酒精中40C保存。当酒精混浊时，更换新的酒精。,固定易出现的问题与主要原因,扭曲变形与过度硬脆容器过小；标本数量过多；固定时间过长。取材过于薄小，尤其疏松结缔组织。表层过度，中间没有固定透取材过厚过大；固定时间不足；固定液失效。固定液浓度高、渗透力强，表面快速硬化。局部固定不佳组织与组织重叠；组织与容器接触；组织露出液面。注意：根据实验目的不同选择适当的固定液。,脱水,（一）脱水的意义与目的常用的固定剂中含有很多水分，在石蜡或火棉胶包埋前。必须用某些溶剂逐步将组织块吸收的水分置换出来，再让石蜡或火棉胶将该溶荆里换，完成包埋步骤。将组织块内水份置换的过程就叫脱水。脱水时必须由低浓度脱水剂开始，逐步转入高浓度脱水剂，以防组织过度收缩而变形，或脱水不完全而影响制片效果。脱水剂必须具有下列特性：脱水剂能与水按比例混合，高浓度，一般指不含水份，脱水剂也能与透明剂混合。前二者特性能达到逐步除去组织块内的水份，使组织块内的水份全部被脱水剂所取代，后二者特性则为透明步骤的透明剂完全取代组织内的脱水剂创造条件。,脱水时间应视组织块的大小及厚度而定，大致处理如下：组织块为3-5毫米厚者，各级酒精为3-6小时，无水酒精对组织有脆化作用，浸泡时间还应缩短。实质性器官，如肾、脾和淋巴结等，在酒情中浸泡时间太久易于硬脆，脂肪组织与疏松结缔组织在酒精中浸饱的时间要长，特别是在95酒精中，以尽量溶去脂肪，并脱净残存的水份，有利于包埋剂渗入组织内。,脱水,目的：利于石蜡包埋剂渗入。酒精脱水：70%和80%：可以长期保存90%、95%：2个小时。100%I、II：各1小时。注意：某些检查，不能经过低浓度酒精脱水。如糖原、尿酸结晶。肝、脾、淋巴结：适当缩短在无水乙醇内的时间。脂肪、疏松结缔组织、脑：适当延长脱水时间。,透明,二甲苯I和II：各10分钟左右。透明时间不宜太长，否则组织收缩硬化。,透明透明在两种情况下进行。,第一，透明是在组织脱水后浸蜡前进行，其目的不在于为了显微镜观察，而是作为从脱水剂进入包埋剂的桥梁。因此，透明剂必须既能与酒精混合，又能与石蜡融合无间，二甲苯即具此性质，故被选为常用的透明剂。第二，透明是在片子脱水与封藏之间进行。其目的除了作为从脱水剂进入封藏剂的桥梁外，尚有使标本透明而便于观察的作用。,浸蜡,透蜡是指将材料中的透明剂逐步清除，以至完全由石蜡充分渗透。,浸蜡,石蜡熔点选择54580C，浸蜡温度较熔点高230C。较硬的致密组织，例如骨、软骨、肌腱、皮肤、子宫肌选用熔点较高的石蜡。疏松及脆嫩组织，例如脑、脊髓、小动物肝脾选用熔点较低的石蜡。石蜡I：1020分钟。石蜡II：2030分钟。石蜡III：3040分钟。,包埋,是把被石蜡浸透的材料连同熔化的石蜡一起倒入一定形状的容器内，并立即投入冷水中，使它凝固成含材料的蜡块，以备切片。,包埋,新蜡反复熔化、冷凝，改善密度，提高韧性，质地均匀。包埋温度65700C.准备工作熔蜡备用；预热包埋用具注蜡、取放组织切面向下摆正压平保留适当距离附贴标记移置冷凝修整蜡块粘贴标记,包埋修块,石蜡,注意事项实质性器官：最大切面向下。空腔性器官：管壁切面向下相同性质的小块组织可以包埋在一个蜡块中。难切的组织单独包埋。操作要迅速，组织不能在空气中停留太久。,石蜡切片,准备工作切片通常46微米展片550C附贴蛋白甘油标记连续切片标记顺序烤片600C石蜡全部融化,切片56m,展片