基因工程制药新教材.ppt

第三章基因工程制药,概述一、基本概念DNA重组（invitroDNArecombinationtechnology）：基因克隆（genecloning）或分子克隆（molecularcloning）技术。基因工程（geneengineering）：,二、基因工程产生的基础1理论上三大发现40年代发现了生物的遗传物质-DNA50年代阐明了生物遗传物质的分子机制，WatsonandCrick提出了DNA双螺旋结构模型。60年代确定了遗传信息的传递方式-中心法则,2技术上三大发明限制性内切酶和连接酶的发现载体（Vector）的发现：载体相当于运送重组DNA分子到宿主细胞的车子逆转录酶的发现，打破了中心法则，使真核基因的制备成为可能,一、重组DNA技术的基本过程基因工程要素目的基因的制备和分离DNA重组体的构建DNA重组体扩增和表达重组体筛选和鉴定外源基因的表达表达产物的分离纯化、鉴定,二、基因工程的分类真核基因工程原核基因工程,三、重组DNA技术-基因工程与医学的关系1.研究基因的结构功能和活动的规律。2.为疾病的防治、诊断、预后及发病机理的研究开辟新途径。3.研究细胞分化和胚胎发育的本质问题。4.基因治疗。5.促进基础理论的研究。,四、基因工程技术制备药物的优势制备很珍贵但利用传统方法难以制备的药可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理、生化和结构进行深入研究，可以发现和挖掘更多的内源生理活性物质。内源生理活性物质在作为药物使用时存在的不足之处，可通过基因工程和蛋白工程进行改造和克服。利用基因工程技术可获得新型化合物，扩大药物筛选来源。,第三节基因工程的酶和载体第一部分：工具酶限制性内切酶和甲基化酶DNA连接酶DNA多聚酶第二部分：基因工程的载体原核细胞（大肠杆菌）的常用载体：真核细胞载体：,第一部分：工具酶一限制性内切酶和甲基化酶限制性内切酶的发现限制性内切酶的生理功能限制性内切酶的分类和命名识别和切割位点及切割片段的末端型酶的分类反应系统限制性内切酶的应用,1限制性内切酶（restrictionendonuclease)定义发现Arber的假说限制修饰酶,2限制性内切酶的生理功能构成了细胞抵御外源入侵DNA的防御机制提供了细菌种属间进行交叉繁殖的屏障，但又允许外源DNA有某些遗漏,3限制性内切酶的分类和命名三种类型：型、型、型命名：EcoRE:Escherichia属Co:coli种R:RY13株：该菌株第一个被发现的核酸内切酶,4型限制性核酸内切酶：识别与切割DNA链上同一个特异性核苷酸顺序，产生特异性的DNA片断。1）基本特性识别与切割DNA链上同一个特异性核苷酸顺序切割片段的末端对dsDNA的两条链同时切割，产生3种不同的切口：,识别序列：,切割末端：,5GTTAAG-3,3CAATTG-5,5GTT-3,3CAA-5,5AAG-3,3-TTG-5,平末端,5CTGCAG-3,3GACGTC-5,5CTGCA-3,3-G,5G-3,3ACGTC-5,5-粘末端,HpaI,PstI,5GAATCC-3,3CTTAAG-5,5-G-3,3CTTAA-5,5AATCC-3,3G-5,EcoRI,3粘末端,5型酶的分类A:Isochizomers(异源同工酶)，来源不同，识别顺序相同的酶。SmaXma它们识别顺序相同，切割位点不同，产生平头或粘性末端。,CCCGGGGGGCCC,CCCGGGGGGCCC,B:,同尾酶（isocaudarner）,来源及识别序列不相同，切割后产生相同的粘性片段,6反应系统组成：酶及活性缓冲液（buffer)：影响酶反应的因素：DNA的纯度DNA甲基化程度DNA分子结构：线性环状反应温度反应系统组成,7限制性内切酶的应用DNA重组组建新质粒组建DNA物理图谱DNA的分子杂交制备DNA的放射性探针DNA的序列分析DNA甲基化碱基的识别与切割。,二、DNA连接酶功能:是指催化两条分别具有5-磷酰基末端与3-羟基末端的DNA单链连接形成磷酸二酯键的酶常用的连接酶：T4DNA连接酶大肠杆菌DNA连接酶,1T4DNAligase来自T4感染的Ecoli，MR:68Kd，辅助因子：Mg2+andATP1）反应特性5ACG-OHP-AATTCGT-3TGCTTAA-P+OH-GCA-5ATPMg2+5ACGAATTCGT33TGCAAGTTCA5,2）20ul反应体系:10*buffer2ul(66mMTris-HCl,pH7.5,6.6mMMgCl2,10mMMDTT,0.4mMATP)底物10pM连接酶：0.01-0.1unit3）反应温度及时间：16，过夜4）用途：粘端DNA或切口间连接，也连接平末端,2大肠杆菌DNA连接酶来自Ecoli,Mr:7.4kDa,辅助因子NAD+。作用：封闭双螺旋DNA上具有5磷酸酰基和3羟基的缺口（nick）形成磷酸二酯键。无法封闭裂口（gap）。因此可连接粘性末端的DNA片断，不能连接平末端的DNA片断。用途：粘端DNA或切口间连接,三DNA多聚酶聚合酶TaqDNA聚合酶逆转录酶(reversetranscriptase)末端脱氧核苷酸转移酶（TerminalDeoxynucleotidaylTransferase）,(一）聚合酶功能：以DNAorRNA为模板，催化DNAandRNA的体外合成。以DNA为模板不耐热聚合酶耐热聚合酶大肠杆菌DNA聚合酶TaqDNA聚合酶Klenow大片段酶pfu聚合酶T4(T7)噬菌体DNA聚合酶以RNA为模板反转录酶,共性：需要引物和模板不能起始新的DNA连，催化dNTP连续加到双链DNA分子引物链3OH端；不发生从引物模板上解离,1大肠杆菌DNA聚合酶（E.coliPolymerase）来自E.coli细胞。Mr:109kD。由单一多肽组成。沿DNA模板催化核苷酸聚合，是一多功能酶，有三种活性：,5-3外切酶,N,3-5外切酶,聚合酶,C,小片段,大片段（Klenow片段）,1）53聚合酶活性在模版指导下，以4种dNTP为底物，催化单核苷酸接合到DNA引物的3-OH末端。5CCGOH5CCGATAGCCTGGCTATCGGAGGCTATCGGA催化合成的要求：模板，4种dNTP，引物，引物与模板形成正确的氢键配对,三种活性：gapfilling:在双链DNA上的缺口部分的3OH末端上附加核苷酸，补平其链部分Nicktranslation:在双链DNA的切口部分的3OH末端附加核苷酸，同时外切性除去5末端的核苷酸。Stranddisplacement:通过在切口的3OH末端附加核苷酸达到置换据有5-末端的链,2）双链特异性的53外切酶活性无dNTP时，从5末端降解ds-DNA成为5单核苷酸。,5CGCATCGGCGTAATC,5CATTAG3GCGTAAGC,PC、PG,3）单链特异性的3-5外切酶活性无dNTP时从3-OH末端降解ss-DNA或游离3_OH末端成为单核苷酸。,5CGCATCG,GCG,5CGC,GCG,PA、PC、PT、PG,5-3外切酶3-5外切酶起始端5-P3-OH断裂位置末端磷酸二酯键3OH末端切除特点配对的不配对的脱氧核糖核苷酸核糖核苷酸,coliDNAPol在基因工程中的用途：制备高比活的DNA探针用于分子克隆DNA序列分析与DNaseI一起使用，进行切口平移通过Okayama_Berg合成cDNA的第二条链,Klenow片段：E.coliDNA聚合酶的一个大片断。MW:7.6KDa。具有聚合酶I的53聚合酶活性在模版和引物存在时，以dNTP做底物，沿5-3方向合成与模版互补的DNA。对单链DNA有35外切酶活性，较弱，不适于3突出端的平滑化无53外切酶活性。,Klenow片断用途：填充用限制酶消化dsDNA的3延伸末端平末端。用32PdNTP进行补平反应，可对DNA3末端进行标记合成cDNA第二条链。寡核苷酸定向诱变中双链DNA合成在SangerddNTP系统中进行顺序分析。,（二）TaqDNA聚合酶TaqDNA聚合酶是耐热的依赖于DNA的DNA聚合酶。MW:6.5kDa.在模版及引物存在的条件下，催化与模版互补的脱氧核苷酸一次选择性地连接在引物的3OH末端上的反应末端A,即粘性末端53外切核酸酶活性有链置换的能力。无35外切核酸酶活性，无校对功能,易突变。Mg2+依赖酶,用途：DNA序列分析；应用于聚合酶连反应（PCR）,对DNA分子的特定序列体外扩增(产物为粘末端）；,pfuDNAPolymerase有DNA聚合酶活性没有逆转录活性有3-5方向的外切酶活性.产物为平末端但是这些聚合酶的产量比TaqDNA聚合酶低。常用于PCR反应高保真,（三）、逆转录酶(reversetranscriptase)1特性：依赖于RNA的DNA聚合酶，又称RNA依赖的DNA聚合酶有效的转录RNA成为DNA产物DNA又称cDNA,即互补DNA(ComplementaryDNA)逆转录酶是一个多功能酶,2活性：将真核生物的mRNA转录成cDNA。单链DNA或RNA为模板时，使用反转录酶制备杂交探针。标记带5突出端的DNA片断。用于双脱氧链法测序反转录PCR。,（四）末端脱氧核苷酸转移酶（TerminalDeoxynucleotidaylTransferase）简称末端转移酶（TerminalTransferase）来自小牛胸腺，Mr:34kD,碱性蛋白质。作用：在二价阳离子存在下，催化dNTP沿5-3方向聚合作用逐个顺序加于线性DNA分子的3OH末端。不需模版，4种dNTP任意一种可作前体物；只一种dNTP组成有一种核苷酸组成的3尾巴，同聚物尾巴,用途：给载体或cDNA加上同聚尾。3末端用32P标记的dNTP标记。利用非放射性标记物生物素-11-dUTP渗入到DNA片段分子的3末端。,第二部分：基因工程的载体一、概述载体的概念（Vector）：凡来源于质粒或噬菌体的DNA分子，可以供插入或克隆目的基因并具有传递运载外源DNA导入宿主细胞能力的DNA片段称为载体。,载体的功能及特征,运送外源基因高效转入受体细胞为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因的扩增或表达提供必要的条件,载体应具备的条件,具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）具有合适的筛选标记具有较高的外源DNA的载装能力具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点,用于基因工程的载体,质粒（plasmid）噬菌体或病毒DNA考斯质粒（cosmid）与噬菌粒人造染色体载体,质粒(plasmid),质粒的基本特征质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子.质粒常见于原核细菌和真菌中绝大多数的质粒是DNA型的绝大多数的天然DNA质粒具有共价、封闭、环状的分子结构，即cccDNA(covalenty,closedandcirculardouble-strandedDNA)质粒DNA的分子量范围：1-300kb,质粒DNA分子构型：三种分子构型：线性(sscDNA)：L-构型环状（OCDNA)：一条保持完整环形结构，另一条链有缺口，OCD构型超螺旋：共价闭合环状DNA(CCCDNA)，呈超螺旋构型,OCDNALDNASCDNA,质粒的特性质粒的自主复制性质粒具有不相容性质粒具有遗传传递和遗传交换的能力。携带特殊的遗传标记,质粒的自主复制性,质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制质粒DNA上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型：严紧型复制控制的质粒1-3拷贝松弛型复制控制的质粒10-60拷贝,质粒的不相容性,任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性，不相容性的质粒组成不相容性群。以大肠杆菌的质粒为例：ColE1、pMB1拥有相似的复制子结构，彼此不相容pSC101、F、RP4拥有相似的复制子结构，彼此不相容p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容,质粒的不相容性：分子机制,两种含有相似复制子结构的不同质粒，在复制时受到同一种拷贝数控制系统的干扰，致使两种质粒的最终拷贝数不同。因此在经过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处于同一细胞内，其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势两种含有不同复制子结构的不同质粒，在复制时各受自己的拷贝数控制系统的调节，致使两种质粒的最终拷贝数恒定。,质粒的可转移性,革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：接合型质粒能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞（接合作用），如F、Col、R质粒等。非接合型质粒不能在天然条件下独立地发生接合作用如Col、R的其它成员值得注意的是，某些非接合型质粒（ColE1）在接合型质粒的存在和协助下，也能发生DNA转移，这个过程由bom和mob基因决定,携带特殊的遗传标记,野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：物质抗性：抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物物质合成：抗生素、细菌毒素、有机碱这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义,质粒作为载体的优缺点优点：分子量小，易操作。大多有抗性标记易导入宿主细胞缺点：插入外源基因的片断不能太大,质粒的分类,人工构建的质粒根据其功能和用途可分成如下几类：高拷贝质粒突变拷贝数控制基因拷贝数1000-3000，扩增基因低拷贝质粒来自pSC101，拷贝数小于10，表达某些毒性基因温敏质粒在不同温度下表现出拷贝数、整合等不同性质测序质粒含有测序通用引物互补序列和多酶接头polylinker整合质粒装有整合促进基因及位点，便于外源基因的整合穿梭质粒装有针对两种不同受体的复制子，便于基因克隆表达质粒装有强化外源基因表达的转录、翻译、纯化的元件探针质粒装有报告基因便于启动子等元件的克隆筛选,（一）质粒-克隆载体,克隆载体三个要素：1）复制子：复制子又称复制起始区，包含控制质粒DNA复制起点和质粒拷贝数等遗传因素。2）选择标记：由质粒编码的选择标记赋予宿主细胞新的表型，用于鉴定和筛选转化有质粒的宿主细胞。最常见的选择标记为抗生素抗性基因，包括氨苄青霉素（amp），四环素（tet），氯霉素（cm），卡那霉素（kan）和新霉素（neo）等。,3）多克隆位点：质粒载体中由多个限制性内切酶识别序列密集排列形成的序列称之为多克隆位点（multiplecloningsite,MCS）。,常用的质粒克隆载体,pBR322质粒图谱,4363bp;Amprandtetr,拷贝数3000松弛型,pUC18/19质粒图谱,（二）表达载体,表达载体具备的条件:载体能够独立的复制稳定的遗传复制、传代能力，在无选择压力下能存在于宿主细胞内。强的启动子，能为大肠杆菌RNA聚合酶所识别。应具有阻遏子，使启动子受到控制，只有当诱导时才能进行转录。强的终止子。好的核糖体结合位点：SD序列、ATG目的基因插入位点筛选标记,2表达载体分类：原核表达载体非融合蛋白表达载体：启动子和核糖体结合位点启动子包括噬菌体PL启动子，T7噬菌体启动子，tac启动子，trc启动子等融合蛋白表达载体。pET系列载体，硫氧还蛋白融合表达载体，Xpress表达系统，GST基因融合系统-pGEX系列载体等。真核表达载体不带病毒复制子带病毒复制子真核表达载体含有原核基因序列和真核转录单位，能在大肠杆菌中自我复制，也能在真核细胞中进行表达。,质粒DNA的分离纯化,实验室一般使用下列三种方法制备质粒DNA：氯化铯密度梯度离心法质粒DNA纯度高、周期长、设备要求高、溴乙锭污染碱溶法质粒DNA纯度低、快速、操作简便沸水浴法质粒DNA纯度、操作周期介于氯化铯法和碱溶法之间,二噬菌体载体1特点：噬菌体容量大噬菌体转染宿主细胞的效率比大肠杆菌转化效率高2-3个数量级2常用的噬菌体载体：噬菌-体衍生物Cosmid,1)噬菌体衍生物噬菌体是双链DNA病毒基因组长度为48502bp分子两端各有12个碱基的单链互补粘性末端。当感染宿主细胞后线性DNA分子会迅速籍助粘性末端互补连接成环，连接区域称为COS（cohesivesite）位点。,-DNA载体的构建：缩短长度,野生型-DNA包装的上限为51kb，本身长度为48.5kb，只有当插入的外源DNA片段不大于2.5kb时，才能被包装成有感染力的噬菌体颗粒。因此缩短野生型-DNA的长度，可以提高装载量。其实野生型-DNA上约有40-50%的片段是复制和裂解所非必需的。根据切除的多少，可将-DNA载体分成两大类载体：插入型载体取代型载体,-DNA作为载体的优点：,-DNA可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌-DNA载体的装载能力为25kb，远远大于质粒的装载量。重组-DNA分子的筛选较为方便-DNA载体适合克隆和扩增外源DNA片段，但不适合表达外源基因,2)Cosmid（考斯质粒，粘性质粒）Cosmid质粒是将质粒和COS粘性末端构建的克隆载体。长度约4-6kb，克隆的真核基因DNA大约在31-45kb。,特点：具有噬菌体粘性末端特性具有质粒载体抗药性标记特性具有一个或多个限制性酶切位点具有高容量的克隆能力接上真核细胞的表达元件，能在真核细胞中表达和生存。,应用：,人造染色体载体,人类、动物、植物的全基因组序列分析往往需要克隆数百甚至上千kb的DNA片段，此时考斯质粒和噬菌粒载体的装载量也远远不能满足需要。将细菌接合因子或酵母菌染色体上的复制区、分配区、稳定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体。当大片段的外源DNA克隆在这些染色体载体上后，便形成重组人造染色体，它能像天然染色体那样，在受体细胞中稳定的复制并遗传。目前常用的人造染色体载体包括：细菌人造染色体（BAC）酵母人造染色体（YAC）,细菌人造染色体（BacterialArtificialChromosomesBAC）,细菌人造染色体通常是在大肠杆菌性因子FF质粒的基础上构建的，其装载量范围在50-300kb之间，各种类型的pBACs在大肠杆菌受体菌只能维持单一拷贝。pBACs主要适用于：克隆大型基因簇（genecluster）结构构建动植物基因文库,酵母人造染色体（YeastArtificialChromosomesYAC）,基因工程的宿主细胞,条件：限制性缺陷型外切酶和内切酶活性缺陷（recB-，recC-，hsdR-）重组整合缺陷型用于基因扩增或高效表达的受体细胞（recA-）具有较高的转化效率具有与载体选择标记互补的表型感染寄生缺陷型防止重组细菌扩散污染，生物武器除外原核：细菌：大肠杆菌、枯草杆菌、链球菌等真核：酵母、哺乳动物细胞、昆虫细胞等,大肠杆菌,遗传背景清楚，载体受体系统完备，生长迅速，培养简单，重组子稳定产结构复杂、种类繁多的内毒素适用于外源DNA的扩增和克隆、原核生物基因的高效表达、基因文库的构建，是DNA重组实验和基因工程的主要受体菌,枯草杆菌,遗传背景清楚，蛋白质分泌机制健全，生长迅速，培养简单，不产内毒素适用于原核生物基因的克隆、表达以及重组蛋白多肽的有效分泌遗传欠稳定，载体受体系统欠完备,酵母菌,具有真核生物的特征，遗传背景清楚，生长迅速，培养简单，外源基因表达系统完善，遗传稳定内源性蛋白产物种类繁多且含量高适用于外源DNA的扩增、克隆以及真核生物基因的高效表达、基因文库的构建、真核生物基因表达调控的研究，是DNA重组实验和基因工程重要的真核性受体菌,昆虫细胞（家蚕）,具有真核生物的特征，外源基因表达量高，繁殖相对较快，培养成本低廉，遗传稳定适用于真核生物基因的高效表达DNA重组操作系统欠完善,哺乳动物细胞（中国仓鼠卵巢细胞CHO）,与人的亲缘关系近，分子重组表达系统健全，具有合适的糖基化修饰系统细胞培养条件苛刻，生长缓慢适用于哺乳类动物和人的基因表达调控研究、基因药物的生产，是DNA重组实验和基因工程的主要哺乳动物受体,实验室常用的基因工程受体,大肠杆菌：用于接受质粒：C600、W3110、HB101、JM83、JM101（Aps、Tcs、Cms）用于接受-DNA：LE392、ED8654酵母菌：毕赤酵母啤酒酵母哺乳动物细胞CHO,第四节目的基因的制备生物合成基因未知基因文库组构建cDNA文库生物合成基因已知(GeneBank可查)聚合酶链式反应（polymerasechainreaction,PCR）逆转录PCR（retrotranscriptionPCR，RTPCR）化学合成,基因工程或DNA重组技术三大用途的前提条件是从生物体基因组中分离克隆目的基因，目的基因获得之后，或确定其表达调控机制和生物学功能，或建立高效表达系统，构建具有经济价值的基因工程菌（细胞），或将目的基因在体外进行必要的结构功能修饰，然后输回细胞内改良生物体的遗传性状，包括人体基因治疗。一般来说，目的基因的克隆战略分为两大类：一类是构建感兴趣的生物个体的基因文库，即将某生物体的全基因组分段克隆，然后建立合适的筛选模型从基因组文库中挑出含有目的基因的重组克隆；另一类是利用PCR扩增技术甚至化学合成法体外直接合成目的基因，然后将之克隆表达。,一、寻找目的基因1基因组文库（genomicDNAlibrary）：是指将基因组DNA通过限制性内切酶部分酶解后所产生的基因组DNA片断随即的同相应的载体重组、克隆，所产生的克隆群体代表了基因组DNA的所有序列，包括外显子和内含子序列。,基因组文库应用：1）原核生物目的基因的分离（目的基因在质粒上）提取质粒DNA限制性酶切从DNA凝胶电泳回收不同大小的片段与载体连接构建物理图谱探针杂交分离目的基因。2）鸟枪法分离基因（目的基因在染色体DNA上）：用限制性内切酶将染色体DNA酶切，得到很多同一般基因大小相当的DNA片断，然后将这些片断混合物随即重组入适当的载体，转化后在受体菌种扩增，再用适当的方法筛选出需要的基因：,鸟枪法克隆目的基因的基本战略,染色体DNA的切断超声波处理：片段长度均一，大小可控，平头末端全酶切：片段长度不均一，粘性末端便于连接，但有可能使目的基因断开，大小不可控部分酶切：片段长度可控，含有粘性末端，目的基因完整与载体连接如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择多拷贝克隆载体；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择表达型载体受体细胞；如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择大肠杆菌作为转化受体细胞如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择能使目的基因表达的受体细胞筛选含有目的基因的目的重组子菌落原位杂交法、基因产物功能检测法（筛选模型的建立）,鸟枪法克隆目的基因的局限性,工作量较大，需要了解目的基因的背景知识不能获得的最小长度的目的基因不能除去真核生物目的基因的内含子结构,2真核生物基因组文库-（cDNA文库含内含子）cDNA文库（cDNAlibrary）建立：从真核细胞分离总RNA,纯化出mRNA,逆转录合成互补的DNA,再在聚合酶作用下合成cDNA第二条链,然后将双链cDNA插入到载体内,构建重组体,转入宿主菌,得到的克隆总和成为该类细胞的cDNA文库.,cDNA文库特征：包含成熟mRNA的全部信息,即包含该细胞内表达的全部蛋白的编码信息.它只包括在特定的组织或细胞类型中已经被转录成mRNA的那些基因序列。其复杂性比基因组文库低。由于不同的细胞类型、发育阶段以及细胞所处的特定状态是由特定基因的表达的所决定的，因此各自的mRNA的种类就不同，由此而产生独特的cDNA文库。,cDNA法克隆目的基因的局限性,并非所有的mRNA分子都具有polyA结构细菌或原核生物的mRNA半衰期很短mRNA在细胞中含量少，对酶和碱极为敏感，分离纯化困难仅限于克隆蛋白质编码基因,二.制备目的基因（一）聚合酶链式反应（polymerasechainreaction,PCR）1基本原理:根据碱基配对原则利用DNA聚合酶催化和dNTP的参与下，引物依赖于DNA模板特性引导DNA的合成。使用PCR法克隆目的基因的前提条件是：已知待扩增目的基因或DNA片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反应必需的双引物变性（denaturation）：943-5min.退火（annealing）：55-60，1min左右。延伸（extension）：72，1min.从引物的3-OH进行延伸，合成方向为5-3,从而合成2分子与原来基因相互补的片段，每循环一次，DNA分子按指数倍增。一般可得到100bp-5000bp的目的基因。,PCR反应要点1）模板DNA模板：0.05-1ug，含单拷贝基因数3*105，RNA模板：RNAcDNA2）DNA聚合酶TaqDNA聚合酶：耐高热，粘末端产物PfuDNA聚合酶：高保真酶。平末端产物3）缓冲系统：4）dNTP浓度：5）引物设计原则：,PCR各要素及其作用,（1）模板PCR模板可以是DNA或RNA。以线性DNA模板为佳，量适中，一般为102105个拷贝；RNA作为模板时，需要：RNAcDNAPCR,称此为RT-PCR.（2）耐热DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)是从耐热细菌体内提取的一种DNA聚合酶，可在95稳定30分钟。从而保证PCR在94变性55退火72延伸循环30次过程中不变性失活。在PCR中，TaqDNA聚合酶应用最广泛。,逆转录,引物,引物是根据已知序列的模板DNA待扩增区两端而设计的一对寡核苷酸小片断，长度一般为1530个碱基。引物是保证PCR扩增产物的大小和特异性的关键因素，其设计与合成对PCR的成功至关重要。引物设计原则如下：,引物设计应符合以下基本原则,长度适宜，一般为1530个碱基；引物的有效长度不能大于38mer，否则最适延伸温度会超过TaqDNA聚合酶的最适温度（72），不能保证PCR扩增产物的特异性G+C含量，一般为4060；G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带4种碱基应随机性分布；ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列,引物自身不应存在互补序列；两个引物之间不应有多于4个碱基的互补；避免两条引物间互补，特别是3端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异性的扩增条带引物3端不应有任何修饰；特别是最末及倒数第二个碱基，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败引物5可以修饰。,引物的特异性：引物必须经GenBank查询后，证实没有与其他非目的DNA有高度互补，才能使用。引物量：每条引物的浓度0.1-1umol或10-100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会,（4）缓冲溶液与Mg2+PCR技术常用1050mmol/LTris-HCl、Ph8.38.88、偏碱缓冲液；并含有一定量的Mg2+浓度；（5）dNTP浓度PCR一般用50200mol/L的dNTP；并且4种dNTP浓度应相等；浓度过高可引起会造成杂带、特异产物带不清晰等不好的结果，浓度过低则得不到所需的产物。最可靠的做法是先做浓度对照,再根据结果决定最佳条件,参数,变性温度与时间一般选择：940C，30秒退火温度与时间取决于引物长度、浓度和G+C含量，一般选择：Tm-5延伸温度与时间一般选择：7075循环次数取决于模板浓度，一般循环：30次,PCR操作,各种PCR反应的操作基本相同，只是根据引物与靶序列不同，选择不同的反应体系和循环参数。将PCR反应管置于DNA自动化热循环仪上，输入各种循环参数，使DNA扩增在热循环仪上很方便地完成。PCR技术优点特异性强、灵敏度高、操作简便、省时，对样本质量要求不高，能快速、特异地扩增任何DNA片断。PCR缺点由于高灵敏度，使易出现假阴性或假阳性结果。,PCR产物分析,（1）凝胶电泳分析法可用琼脂糖（Agrose）或聚丙烯酰胺（PAGE）凝胶电泳检测PCR扩增产物的大小。同时应以标准DNA分子量作平行对照，凝胶中加入溴化乙锭，电泳后，紫外检测仪下观察结果并拍照。（在待检靶序列拷贝数多、且仅扩增出一条带时，用此法即可满足检测要求。）,点杂交分析法,该法有2种：将扩增产物直接固定在膜上，每一个探针制备一张膜，然后用不同的特异探针进行杂交；将不同的探针固定在膜上，再用有标记的PCR产物与之杂交。本法有助于检测突变DNA类型，用于人类遗传病诊断合某些基因的分析。(当扩增产物时多条带时，用此法更合适。),PCR应用基因结构的研究：基因组制图预测序；分子杂交探针；DNA定型；PCR直接测序；利用免疫PCR检测抗原和抗体。基因表达与调控研究：mRNA检测；调控元件分析；蛋白质和DNA相互作用的研究。基因工程上构建5端内切酶接头，构建cDNA文库。医学上用于遗传及传染性疾病的基因诊断。制药中筛选抗肿瘤抗生素。鉴别菌株,（二）逆转录PCR（retro-transcriptionPCR，RTPCR）mRNA的纯化cDNA第一链的合成cDNA第二链的合成,mRNA的特征及纯化含量低，占总RNA的1-3%,大小不均。3端含50-250个A（多聚腺嘌呤核苷酸）纯化利用Oligo（dt)固定相（生物素化寡脱氧胸腺核苷酸）。总RNA流经固定相，mRNA吸附于固定相上，tRNA和rRNA流出。洗脱，收集mRNA。,（三）DNA化学合成一般DNA合成都采用固相亚磷酰胺三酯法合成DNA片段，此方法具有高效、快速偶联等优点，已在DNA化学合成中广泛使用。DNA化学合成不同于酶促的DNA合成过程从53方向延伸，而是由3端开始。具体的反应步骤如下：,全基因合成,化学合成目的基因的前提条件是基因的DNA序列已知，有三种策略。,化学合成法的基本策略,全基因合成上述三种方法各有利弊：化学合成DNA的单片段愈短，收率就愈高，但由于化学合成的份额较大，成本较高；在大片段酶促法合成目的基因时，虽然化学合成的份额相对较小，成本较低，但大片段化学合成的收率极低，例如，每聚合一个单体的产物收率为95%则合成50个碱基长的DNA单链大片段的总收率只有7.7%,重组DNA技术的操作过程,A：DNA的体外重组（切、接）B：重组DNA分子的转化和扩增（转、增）C：转化子的筛选和鉴定（检）,第五节DNA的体外连接载体DNA与目的基因DNA片段通过连接酶催化连接，形成重组子（recombinant），称为DNA分子体外重组。,一连接反应机制,重组率,重组率的定义重组率=含有外源DNA的重组分子数/载体分子总数在常规实验条件下，重组率一般为25-75%重组率是衡量连接反应效率的重要指标，较高的重组率可以大大简化DNA重组的后续操作。,第六节重组DNA分子的转入和扩增（转与增）重组DNA分子导入受体细胞的原理与技术转化率转入细胞的扩增受体细胞（宿主细胞）原核细胞：大肠杆菌、枯草杆菌、链球菌真核细胞：酵母、哺乳动物细胞、昆虫及植物细胞等。,受体细胞选择：限制酶缺陷型菌株（R-，RestrictionNegtive）-重组缺陷型菌株(Rec-,RecombinationNegtive)-互补功能：感受态（competent）细胞：,常用的导入方法转化（transformation）：以质粒DNA或重组DNA导入受体细胞，从而使受体细胞遗传性状发生改变的过程，最常用的有效的基因克隆方法之一。转染（transfection）：将温和的噬菌体、病毒或以其为载体构建的重组体，体外包装成具有感染性的病毒颗粒，然后直接感染大肠杆菌，使其进入宿主细胞。这种由寄主细胞捕获裸露噬菌体的过程称为转染，转化的特殊形式,CaCl2转化法Ca2+诱导的完整细菌细胞的转化：Ca2+诱导的完整细胞的转化适用于革兰氏阴性细菌（如大肠杆菌等），1970年建立此技术，其原理是Ca2+与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现空隙，细菌细胞此时的状态叫做感受态。,大肠杆菌感受态细胞的制备,100ml菌体培养至OD600=0.5，离心收集菌体用10ml冰冷的10mMCaCl2溶液悬浮菌体，离心收集菌体用1ml冰冷的75mMCaCl2溶液悬浮菌体冰浴放置12-24小时，备用,大肠杆菌感受态细胞的质粒转化,取100l感受态细胞，加入相当于50ng载体的重组DNA连接液，混匀冰浴放置半小时在42保温2分钟（热脉冲）快速将转化细胞转移至冰浴中放置1-2分钟加入1ml新鲜培养基，于37培养1小时（扩增）涂在合适的固体培养基平板上进行筛选,细菌原生质体（Sepheroplast）的转化,革兰氏阳性细菌（如枯草杆菌、链霉菌等）接纳外源DNA的主要屏障是细胞壁，因而这类细菌通常采用原生质体（细胞去壁后的形态）转化的方法转移质粒或重组DNA分子酵母菌、霉菌、植物细胞也可用原生质体法进行转化,细菌原生质体的制备,不同细菌的原生质体制备方法不尽相同，以链霉菌为例：细菌需生长在高渗培养基中（如34%的蔗糖溶液，并加入甘氨酸以增加细菌细胞壁对溶菌酶的敏感性。在制备过程中，菌体应始终悬浮在10.3%的蔗糖等渗溶液中。与原生质体接触的所有器皿应保持无水无去污剂。,细菌原生质体的转化取0.2-1ml的原生质体悬浮液（108-109个原生质体），加入10-20lDNA重组连接液，同时加入含有PEG1000和Ca2+的等渗溶液，混匀细菌原生质体的再生原生质体再生的主要目的是使细菌重新长出细胞壁。再生在特殊的固体培养基上进行，内含脯氨酸和微量元素,噬菌体DNA的转染(transfection),重组体体外包装，将以DNA或Cosmid为载体构建的重组DNA倒入大肠杆菌，在宿主细胞内繁殖的过程。感受态细胞的培养：将大肠杆菌在含有麦芽糖（不含葡萄糖）和MgCl2的培养基中培养至OD600=0.5吸附：加入经体外包装好的重组噬菌体悬浮液，30保温10分钟转染裂解：加入20倍体积的新鲜培养基，30培养2小时，直至培养液中菌体裂解，培养液澄清度增加，然后涂板筛选,电穿孔转化,电击法，又叫电穿孔法(electroporation)将待转化的质粒或DNA重组连接液加在电穿孔转化仪的样品池中，两极施加高压电场。在强大电场的作用下，细菌细胞壁和细胞膜产生缝隙，质粒或DNA重组分子便可进入细胞内。电穿孔转化法操作简单，而且几乎对所有含细胞壁结构的受体细胞均有效，但转化效率差别很大。同样的原理，电穿孔法也可用于质粒消除实验,重组DNA分子导入酵母菌,电感受态细胞制备：从新鲜平板挑取单菌落接入2mLYDP试管28，220rpm,培养24h吸取100ul转接入50mLYDP28，220rpm,OD600=1.3-1.5离心菌体用50mL冰浴无菌水洗涤（两次）用25mL预冰的1M山梨醇洗涤离心菌体悬浮于2ml冷山梨醇电感受态细胞电转化重组DNA线性化与上述感受态细胞混合冰浴放置5min电转化（1.5kv,25uF，5-6ms）立即加入200l1M冷山梨醇混匀后转入EP管，于30震荡培养30min将转化子涂于含抗性的MD平板30培养至转化子长出,影响电穿孔导入DNA的因素：外加电场的强度哺乳动物：250-750V/cm酵母一般在1500V/cm电脉冲时间20-100ms；工作温度0-25；DNA构象和浓度，线状比环状好，浓度1-40u/ml；阻抗：200-400,重组DNA导入链霉菌中原生质体转化接合转移电脉穿孔噬菌体转染与转导,（一）原生质体法1：制备:2ml新鲜种子液接入50ml培养基28培养离心收集菌体（3000rpm10min）菌丝体用10.3%蔗糖洗涤两次悬浮于溶菌酶溶液中30培养相差显微镜观察原生质体形成温和离心除去菌体上层溶液离心收集原生质体悬浮于P溶液中,2：转化：20ul重组DNA0.05ml原生质体（显微计数106)混匀，立即加0.5mlT缓加入0.5mlP缓离心沉淀悬浮于1mlP缓200ul涂平板30培养想培养至菌落长出,（二）接合转移DNA以单链的形式进入宿主菌。从大肠杆菌到链霉菌质粒的转移需要顺式转移起始点(oriT)和反式转移功能（tra）。供体一般用大肠杆菌S17-1菌株，它含有具接合功能的整合型RP4，可以介导质粒的转移，在链霉菌受体中DNA可以以质粒的形式或整合形式存在,（三）电穿孔在电脉冲条件下，质粒DNA可以从细胞中释放或被吸收。DeviesJ等利用S.paroulusandS.vinaceusNCIB8852整个菌体进行电穿孔，比原生质体转化效率提高10-100倍。将含质粒的链霉菌菌丝悬液与大肠杆菌感受态细胞用电脉冲刺激，可以将质粒直接转移至大肠杆菌。（四）噬菌体转染与转导对于某些限制修饰较强的链霉菌，该法比较有效。应用带正电荷无DNA脂质体可增加转染的效率。,转化率,转化率是衡量转化效率的重要指标，其定义为：每微克载体DNA在最佳转化条件下进入受体细胞的分子数。由于在一般的转化实验规模下，每个受体细胞最多只能接受一个载体分子，因此转化率的定义也可以表征为：每微克载体DNA转化后，受体细胞接纳DNA的个数，即克隆数（在筛选时，未接纳载体或重组子的受体细胞不长）,转化子的筛选和鉴定（检）,载体遗传标记检测克隆DNA序列检测外源基因产物检测,载体遗传标记检测,抗药性筛选法基本原理：利用载体上的遗传学标记如抗生素抗性基因,外源基因插入载体并转入受体细胞后，使受体细胞获得或缺失这些标记表型。插入失活法插入表达法抗药性筛选法可区分转化子与非转化子、重组子与非重组子,插入灭活法(insertioninactivation),适用于具有两个或两个以上选择标记的质粒如:pBR322的双抗生素抗性标记可鉴别出重组体和非重组体,插入表达法,二.营养缺陷型筛选法（遗传互补法）其原理是：载体分子上携带某种营养组份的合成基因，而受体细胞本身不能合成这一营养组份，将转化细胞涂布在不含此营养组份的培养基上，长出的便是转化子。营养缺陷型筛选法可以区分转化子与非转化子，一般不能区分重组子与非重组子。,三.显色筛选法显色筛选法的基本原理：载体分子上携带某种显色酶基因，其表达产物能使细胞产生颜色反应，从而易于辨认和挑选，如大肠杆菌质粒pUC18携带的lacZ基因（蓝色反应）、链霉菌质粒pIJ702携带的melC基因（黑色反应）等显色筛选法可以区分转化子与非转化子，也可区分重组子与非重组子。,蓝白筛选,pUC载体及其衍生质粒含有lacZ基因该基因编码大肠杆菌-半乳糖甘酶氨基端的互补肽段，宿主细胞的-半乳糖甘酶缺陷型。在异丙基-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导下，含有该类载体的宿主细胞的两个互补肽段产生活性，可分解培养基上的底物5-溴-4-氢-3-吲哚-D-半乳糖苷（X-gal），形成蓝色菌落。当外源基因插入lacZ基因内部的多克隆位点，X-gal的培养基的重组子由于lacZ基因的插入失活而呈白色，而含有空载体的宿主细胞显蓝色，从而达到被鉴定筛选的目的。,四.噬菌斑形成筛选法,噬菌斑形成筛选：噬菌体包装外源DNA分子后重组分子的长度为其野生型的75105时，能形成有活性的噬菌体颗粒，并在平板上出现清晰的噬菌斑。,克隆DNA序列检测,限制性酶切图谱法所谓的限制性酶切图谱法就是对载体上插入的外源DNA片段进行酶切图谱分析，并以此与目的基因的已知图谱对比，因此利用这种方法不仅能区分重组子与非重组子，而且还能鉴定目的重组子。但这种方法在用于数千规模的转化子筛选时，工作量极大，实验成本也高。,Southernblot,鉴别DNA的杂交称为Southernblot。杂交的受体是DNA片断，探针可用DNA也可用RNA.步骤：提取重组DNA或基因组DNA限制性酶切DNA凝胶电泳分离转膜杂交（用各种标记的DNA或RNA探针）显色或曝光确定与探针互补的电泳条带的位置,Northernblot,鉴别RNA的杂交称为Northernblot。杂交的受体是RNA片断，探针可用DNA也可用RNA,受体从DNA凝胶转移到NC上，与探针片段进行杂交。提取细胞RNA电泳分离转膜杂交检测,Westernblot,SDSPAGE转膜第一抗体酶标第二抗体显色反应,ELISA,（enzymelinkedimmunosorbentassay）可用于检测抗原，也可用于检测抗体可检测ng水平的蛋白质,酶标仪,4固相反射免疫测定：原理同ELISA5免疫沉淀反应：可检测mg/ml水平的蛋白质6放射免疫沉淀反应可溶性抗原与特异性抗体的结合；细胞中提取的蛋白质混合物中靶抗原的定性与定量；选择性好，特异性高；100pg；步骤：1）标记可表达靶蛋白的细胞；35S-甲硫氨酸/半胱氨酸；125I；2）裂解细胞；3）形成特异性免疫复合物；4）收集并纯化免疫复合物；5）分析免疫沉淀物中的放射性标记蛋白。,基因表达,基因表达是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程。大肠杆菌表达系统链霉菌表达系统酵母表达系统,一、大肠杆菌表达系统,大肠杆菌作为外源基因的表达宿主优势：遗传背景清楚技术操作简便，培养条件简单，培养周期短目标基因表达水平高可大规模发酵且较经济是目前应用最广泛、最成功的表达体系。,（一）目的基因,基因编码序列的5端使用偏倚密码子更能提高表达效率目的基因处于正确的阅读框架大肠杆菌表达真核基因应注意使用大肠杆菌启动子：真核基因必须置于载体的SD序列下.使用cDNA:不含信号肽编码序列当影响产物的活性时应选用真核系统表达,（二）宿主细胞,易于进行重组体筛选。遗传稳定性高，易于培养或发酵。利于外源蛋白表达产物积累。宿主细胞在遗传密码子的应用上无明显偏倚性。无致病性。具有好的转译后加工机制,（三）影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素,外源基因的拷贝数外源基因的表达效率表达产物的稳定性细胞的代谢负荷工程菌的培养条件,1外源基因的拷贝数载体拷贝数决定着外源基因的拷贝数外源基因克隆到高拷贝数质粒上表达质粒拷贝数增加外源基因拷贝数增加基因表达产物增加2外源基因的表达效率启动子的强弱核糖体结合位点的有效性SD序列和起始密码子ATG的间距密码子的组成等,3表达产物的稳定性组建融合基因，产生融合蛋白把真核基因产物运输到胞浆周质的空隙中，或分泌至培养基中采用位点特异性突变方法，改变真核蛋白二硫键的位置，从而增加蛋白的稳定性。选用蛋白酶缺陷型宿主菌，减弱表达产物的降解。共表达能提高特定目标蛋白的稳定性的辅助因子，如蛋白分子伴侣等。,4细胞的代谢负荷影响：外源基因表达产物可能对宿主有毒性。大量的外源产物可能打破宿主细胞的生长平衡。宿主细胞的代谢受阻，反过来会影响外源基因的表达。采取的措施：细胞生长和外源基因的表达分为两个阶段：细胞生长期，外源基因表达期。