蛋白层析仪器系统 教育学习

蛋白层析系统,李秀男Email:xnli中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室,1,优质课件,主要内容,1.概述2.蛋白层析系统的组成3.输液系统4.进样系统5.检测系统6.日常维护7.选型购买,2,优质课件,1概述,液相色谱（层析）的发展古罗马时期人们用布或纸分析染料与色素；1903年，Tsweet发表首篇有关层析的论文；1960s,HPLC商用仪器出现高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法,3,优质课件,层析分类,4,优质课件,2.蛋白层析系统的构造,输液系统：(1)提供连续、稳定而精确的流量；(2)进行梯度洗脱；进样系统：引入样品层析柱检测系统：对分离后各组份进行检测给出响应信号，并进行处理产品收集系统：收集分离产物,5,优质课件,构造简图,六通阀,6,优质课件,AKTA组成示意图,7,优质课件,堆积型,GradiFrac(GE),国产,8,优质课件,简单整合型,AKTAPrime(GE),BioLogicLP(BioRad),9,优质课件,复杂整合型,AKTAExplorer(GE),BioLogicLP(BioRad),10,优质课件,按规模分,实验室规模AKTApure流速20个柱体积）；当发现进错样时，不可以为了节约时间，而直接用100%流动相B（有机相）洗脱，否则会不可逆地损坏层析柱。,29,优质课件,4进样系统,手动进样直接倒入柱子顶部进样阀进样自动进样泵进样柱切换进样,30,优质课件,进样阀,手动进样阀自动进样阀,定子（Stator）,转子（Rotor）,31,优质课件,AKTA进样阀操作,32,优质课件,手动进样注意事项,进样动作：Load状态时平缓推针，切换到Inject后再拔针以防倒吸清洗：在Inject状态清洗进样口对于Rheodyne进样器一定要使用合规格的进样器，规格为外径0.028英寸，长2英寸的平头针。一定不能使用尖针，它会严重刮坏转子垫圈。废液口：出口末端应与进针口水平以防倒吸或虹吸,33,优质课件,进样阀操作注意事项,进样阀靠转子和定子的面密封，无法保证100%不泄露缓冲液泄露会导致盐析出，损伤密封面和导流槽，严重时造成漏液和两个导流槽之间短路实验完成后用纯水在load和inject状态下清洗，20%乙醇保存使用完高盐溶液后用纯水冲洗至少半个小时,定子（Stator）,转子（Rotor）,34,优质课件,自动进样,进样动态范围广样品残留少(连续洗针系统)延迟体积少进样重复性高(0.5%RSD)主要应用于分析型色谱,35,优质课件,泵进料,针对料液中目标产物浓度极低，料液体积较大的情况（如用离子交换捕捉发酵液中表达量非常低的基因工程蛋白质）；料液前处理非常重要，进料前必须用0.45m或更小孔径滤膜严格过滤；进料过程必须密切注意压力变化；推荐使用蠕动泵进料。,36,优质课件,柱切换进料,解决下列问题人工换柱带来的泄漏和污染周期长导致蛋白质失活通量低和收率低,37,优质课件,多柱组合层析,38,优质课件,多柱组合层析纯化蛋白质实例,白蛋白、AT-、运铁蛋白均达到了电泳纯（纯度99%）1-AT和结合珠蛋白（两个条带）的纯度也在95%以上整个过程用时140分钟采用收集洗脱峰，人工换柱层析，则至少需要3天,39,优质课件,5检测系统,光学检测器（如紫外-可见、荧光、示差折光、蒸发光散射、多角度激光散射等）热学检测器（如吸附热等）电化学检测器（如pH、极谱、库仑、安培等）电学检测器（如电导等）,古老的方法：目测、离线显色反应,40,优质课件,目测法,色谱名称的由来最古老原始的方法在玻璃柱中观察带颜色物质形成的条带,41,优质课件,显色反应,没有在线检测器针对一些没有紫外吸收的物质，如多糖，PEG等设备要求低工作量大,42,优质课件,紫外-可见检测器,主要组成部分光源分光系统样品池光强探测器分类固定波长检测器可变波长检测器单波长检测器多波长检测器二极管阵列检测器,纵坐标为吸光度A，横坐标为时间作出的曲线即为层析图谱,43,优质课件,固定波长紫外检测器,汞灯光谱图,滤光片原理示意图,44,优质课件,固定波长紫外检测器,PharmaciaUVMonitorUV-1AKTAPRIME和UPC所配检测器,国产8823B,汞灯为光源，荧光片和滤光片来选择波长，通常为254和280nm，分别用于核酸和蛋白的监测结构简单，价格较便宜可配套国产色谱工作站（如N2000）进行数据采集,45,优质课件,可变波长紫外-可见检测器,氘灯光谱图,钨灯光谱图,氘钨双光源光谱图,46,优质课件,AKTA检测器,氙灯光谱图,氙灯作为光源优点：全波长、光强高缺点：脉冲灯，每次闪耀光强不一样,47,优质课件,二极管阵列和CCD检测器,48,优质课件,紫外检测器光源,一台AKTA开灯后，每小时光源烧掉10元，如果加上光栅的损耗（60,000元/3000hr），每小时耗费30元，一天（8小时）为240元，一个月（20天）为4800元；为节省操作费用，必须注意：装填、平衡或者冲洗层析柱时不需要开灯；完成实验后冲洗系统前把紫外灯关闭；,49,优质课件,AKTA紫外可见检测器操作注意事项,汞灯、氘灯、钨灯使用寿命和点燃次数相关氙灯寿命与使用时间有关，和点燃次数无关因此，在不必要的时候，例如装填、平衡或者冲洗层析柱时随手关灯多波长检测时，光栅一直处于旋转状态，两个波长差别越大，旋转角度越大，影响寿命因此，如无特殊需要，最好使用单波长检测,50,优质课件,6.维护每天,系统清洁擦拭外表，防止试剂或结晶的盐腐蚀设备溶液和样品必须过滤检查系统管路和接头有无破损，系统是否渗漏。使用完毕，须用水将系统冲洗干净，之后用20%乙醇清洗系并保存所有的流路。,pH计使用前校正pH计。用后将pH计拆下放入保护液（1:1pH4buffer和2MKNO3，或pH4.0的饱和KCl溶液）。,泵检查泵头周围是否渗漏，如果泵头有渗漏,或是流量不准确，则需更换泵头密封圈。更换缓冲液时，需排尽泵头里的残存气泡，否则会影响流速的准确性。,51,优质课件,维护每周,在线滤器清洗过滤片，如有必要须更换过滤片，否则会形成很高的在线压力，流速降低。,泵冲洗系统更换泵后冲洗液（20%乙醇）。如果冲洗液瓶中液体量增加，说明泵头密封圈渗漏，须更换。如果冲洗液不循环，说明单向阀堵塞或损坏，需要清洗或更换。,缓冲液筛网检查入口溶液的筛网是否很脏，如有必要须更换。,52,优质课件,维护每月,系统清洗按时清洗系统或在遇到问题时清洗系统。用1MNaOH，执行SystemWash指令，之后立即用水将NaOH冲洗干净。检查泵头单向阀工作是否正常。,在位清洗根据样品的脏/干净的程度，可按软件中CIP程序定期清洗系统，防止系统管道被堵，压力增高。11,53,优质课件,维护每半年,紫外可见检测器用注射器推10%的表面活性剂SDS注入紫外流动池停留20分钟，用水冲洗。用用注射器推甲醇或1MNaOH注入紫外流动池，停留20分钟，用水冲洗。,pH/电导检测器清洗流动池：拆下pH电极，用1MNaOH清洗pH和电导流动池30分钟，用水冲洗。清洗pH电极（响应慢或校正斜率小于80%时）：1.盐沉积：0.1MHCl/0.1MNaOH/0.1MHCl交替洗数次，间隔5分钟。2.油脂沉积：1%SDS清洗后水洗。3.蛋白沉积：1%蛋白酶于0.1MHCl溶液中清洗后水洗。,压力检测器零点校正（pressureoffset)。,54,优质课件,7.蛋白质层析系统选择,明确自己的目的，工艺探索？方法验证？不要盲目崇拜仪