《DNA分子的克隆》PPT课件.ppt

第四章DNA分子克隆,基因克隆方案,重组子的筛选,目的基因片段的获得,体外重组P102,重组DNA导入受体细胞扩增或表达,克隆路线p100,第一节重组体导入受体细胞P109,接合转化噬菌体转染噬菌体转导CaCl2转化法（化学方法）高压电穿孔法转化显微注射法转化基因枪法,转化常用方法：,生物转化法,物理转化法,转化(transformation)：感受态的大肠杆菌捕获和表达质粒DNA的过程。转染(transfection)：感受态大肠杆菌捕获和表达噬菌体DNA的过程。转导(transduction)：噬菌体将一个细胞的基因传递给另一细胞的过程。,生物转化法,一、CaCl2转化法,感受态细胞(Competentcells):受体细胞经过一些特殊方法的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为最适摄取和容纳外源DNA的生理状态。目的：增加受体菌细胞膜的通透性。,CaCl2转化法基本原理,1970年建立此技术，Ca2+诱导的完整细胞的转化适用于革兰氏阴性细菌（如大肠杆菌）,0低渗的CaCl2处理使大肠杆菌进入“感受态”（膜磷脂在低温下形成液晶结构，细胞吸水膨胀)，外源DNA与Ca2+形成复合物粘附在表面，而热休克使内外膜温度不平衡，细胞膜出现空隙，这样DNA得以进入细胞，然后进行转化子的筛选。,CaCl2转化法要点：,1.培养对数生长期细菌：OD600=0.4-0.5；2.冰浴0CaCl2处理；3.获得感受态细胞：收集菌体、用冰冷的CaCl2悬浮、分装细胞。低温保存12-24小时。4.42热休克处理1-2min；5.恢复培养：加入无抗生素培养液37培养1h6.筛选转化子：用含抗生素的培养基培养10h。,二、电击法（electroporation）or电穿孔法,基本原理：将待转化的重组质粒加在电穿孔转化仪的样品池中，两极施加短时高压电场，细胞壁和细胞膜产生缝隙，在细胞膜双脂层上形成瞬时微孔，重组质粒DNA可进入细胞。,优点：操作简单，但转化效率差别很大。材料、电压、时间、温度均影响转化效率。要求DNA大小无限制、宿主细胞广泛。控制好电压和电击时间，否则会对细胞造成不可逆的击穿。,电穿孔转化仪,三、显微注射法（microinjection）,使用极细的毛细管在显微镜下将目的DNA注射到动物细胞或植物原生质体的一种直接方法。直接把外源DNA注射到宿主细胞核里，使其整合到染色体上。优点：可操作性强，转化率高。缺点：需有相当精密的显微操作设备，操作繁琐,四、基因枪法（genegun）-微弹轰击法（particle-bombardment）,将外源DNA包被在微小的金粒或钨粒（0.6-1um）表面，然后在高压的作用下将微粒高速射入受体细胞或组织，微粒上的外源DNA进入细胞整合到染色体上并表达，实现基因的转化。,费用高：250毫克金粉4300元，1克钨粉250元,不受材料限制；但多拷贝插入chr。,重组子（recombinant）：含有重组DNA分子的转化子。,第二节重组体克隆的筛选和鉴定,转化子（transformant）：将导入重组载体分子后能稳定存在的受体细胞称为转化子。,转化子：载体自连、载体与多个DNA相连、多拷贝外源DNA相连接、单拷贝DNA与载体连接,一、表型特征筛选1、利用抗生素的插入失活筛选转化子,不同抗性遗传标记的使用：,1、Ampr：表达产生-内酰胺酶，降解Amp，使用浓度：30-50ng/ml2、tetr：编码改变细菌膜的蛋白，阻止Tet进入细胞，使用浓度：12.5-15.0ug/ml3、Cmpr:cat基因转译氯霉素乙酰转移酶（CAT），使Cm乙酰化而失效，终浓度：30ug/ml4、Knr：编码修饰卡那的酶，阻止kn对核糖体的干扰，终浓度：5ug/ml,2、lacZ基因插入失活,-互补菌落蓝白选择IPTG、x-gal,菌落蓝白选择,3、插入表达筛选法：外源基因插入后激活标记基因表达，据标记基因的表达产物进行筛选。标记基因上游存在负调控序列：如CI基因在terr上游，抑制terr基因表达，DNA插入CI内，CI基因失活，terr表达。,4、噬菌斑筛选法：噬菌体DNA包装长度：36-51kb转化子：裂解宿主清形成晰噬菌斑非转化子：正常生长无噬菌斑插入型载体（37kb）：lacZ筛选替换型载体（26kb）：清晰噬菌斑是重组子,二、根据插入基因的表型选择,利用插入的外源基因的表达产物特性进行直接选择。（只在特定条件下）。,1.弥补缺陷,转化进来的外源基因产物能够弥补受体菌株的突变型缺陷。,小鼠的二轻叶酸还原酶（DHFR）对三甲氧苄二氨嘧啶有抗性。,DHFR,载体,连接,转化受体菌,三甲氧苄二氨嘧啶培养基平板,含DHFR的克隆才能生长,使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。,2.增加新性状,三、菌落原位杂交法（insituhybridization）,筛选基因组文库、cDNA文库。,Southernblotting,Northernblotting,用DNA（或RNA）探针检测DNA样品。,从宿主细胞中提取DNA（或质粒载体），再用探针杂交。,用DNA（或RNA）探针检测RNA样品。,主要检测插入片断是否被转录。,核酸探针（probe）的制备,探针:带有检测标记能够与目的基因或目DNA片段同源互补的一段核苷酸序列。可以是DNA也可以是RNA；长度一般50-300bp,（1）利用完整基因或基因一部分（2）通过查询序列人工合成或PCR扩增（3）据氨基酸序列推导（简并密码），20-50bp（4）标记的cDNA片段，用于cDNA文库筛选髙丰度mRNA：兔网织红细胞mRNA80编码珠蛋白。,四、免疫化学检测法,对表达产物的检测。蛋白蛋白“杂交”,利用抗体作为“探针”来检测转入受体菌并且表达出相应的蛋白质的外源基因。,1、放射性抗体检测法,待测基因产物蛋白,一抗,125I标记的二抗,固相支持滤膜,2、免疫沉淀检测法,方法：把非放射性抗体加到平板培养基中，当插入基因的表达产物被细菌分泌到菌落周围时，就会与抗体反应形成“沉淀圈”。,抗原抗体凝集反应。,检测分泌型产物。,对于不能被分泌到菌体外的蛋白质可先进行原位溶菌处理。,免疫印迹（westernblotting）、ELISA。,五、结构分析筛选,1、酶切方法检测质粒是否含有插入子。单酶切、双酶切，比较DNA带数和长度,3、PCR扩增鉴定筛选PCR能在模板序列上扩增出预期DNA片段。,2、电泳检测质粒的大小变化，推测是否包含插入子。自身环化、载体部分缺失、未完全消化、多连体、两载体连接,重组质粒的酶切,Marker23.19.46.64.42.32.0,M12356pBSKS,1、2、5、6是需要的扩增质粒,重组质粒的PCR扩增,1#2#3#4#5#6#MpBSKS,1、2、3、5、6质粒可能是目标的扩增质粒,六、转译筛选法,借助无细胞翻译系统，通过表达或抑制所选择的克隆载体上的外源基因的转译，筛选其产物是否符合预期的结果。,无细胞翻译系统：能把外源的mRNA翻译成蛋白质的细胞提取物。如：麦胚提取物系统、网织红细胞提取物系统。,1、转译筛选的原理,mRNA,无细胞翻译系统,35S标记的甲硫氨酸,翻译,35S标记的肽链,PAGE电泳,放射自显影,比较放射性带纹的位置,载体+外源DNA,转录,与预期的产物分子量相符？,2、杂交抑制转译法（HART）,mRNA一旦与DNA杂交成RNA-DNA双链后就不能被核糖体翻译出蛋白质（转译被抑制）。,1.原理,适用于mRNA转录丰度高的外源基因。,3、杂交释放转译法（HRT）,原理：,载体上克隆的cDNA与它的mRNA杂交吸附，在高浓度的甲酰胺溶液加热洗脱，释放出与它对应的mRNA，进行体外转译。研究其转译产物的性质是否是预期的基因产物（如分子量、免疫源性等）。,可用于低丰度mRNA的检测。,过程,硝酸纤维素滤膜,载体和插入的cDNA,总mRNA,cDNA基因的mRNA,杂交,洗脱,cDNA基因的mRNA,体外翻译,cDNA编码的蛋白,电泳,凝胶放射自显影,cDNA编码的蛋白,硝酸纤维素滤膜,载体和插入的cDNA,硝酸纤维素滤膜,载体和插入的cDNA,收集,35S标记的氨基酸,七、植物转化报告基因（reportergene)筛选法,（1）大肠杆菌的-D-葡萄糖醛酸糖苷酶（-D-glucuronidase，GUS）；5-溴-4-氯-3-吲哚-D-葡糖醛酸-蓝色水解物,（2）细菌和萤火虫的荧光素酶（luciferase）；淡黄色荧光,P119,报告基因(reportergene)是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，其表达产物非常容易被鉴定。把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因，在调控序列控制下进行表达，从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控，筛选得到转化体。,（4）Bar、Npt、HPT等,（