《CR及质粒提取》PPT课件.ppt

PCR技术,聚合酶链式反应（polymerasechainreaction,PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，是分子克隆技术中的常用技术之一。PCR具有反应快速、灵敏、操作简便等优点，已广泛应用于分子生物学的各个领域。,实验目的：掌握PCR原理，学习PCR操作过程。实验原理：在微量离心管中，加入适量的缓冲液，模板DNA，dNTPs，TaqDNA聚合酶，一对引物，以高温变性、低温退火和中温延伸三个反应为一个循环，经过2535次循环，最终使特异区段的DNA扩增数百万倍，满足分子生物学下游操作。,PCR扩增反应体系：,1.PCR扩增反应体系,2.PCR扩增程序设置,预变性945变性9430退火6030延伸7240补充延伸72108保存,30个循环,碱裂解法提取质粒DNA,质粒(plasmid)是存在于细菌染色体外的环状双链DNA。具有可自主复制、传给子代、也可丢失及在细菌之间转移等特性，与细菌的遗传变异有关。作用：携带外源基因进入细菌中扩增或表达的主要载体，在基因克隆、表达中具有重要作用。,基因克隆操作步骤（五字经）分载体和目的基因的分离切限制性内切酶的应用接载体和目的基因拼接成重组体转重组体的转化筛DNA重组体筛选与鉴定,质粒的提取方法很多，大多包括3个主要步骤：细菌的培养、细菌的收集和裂解、质粒DNA的分离和纯化。本实验以碱裂解法为例，介绍质粒的提取过程。,实验目的：掌握碱裂解法提取质粒的原理、步骤及各试剂的作用。,实验原理：在碱性环境中，细菌染色体DNA变性分开，而质粒DNA虽变性但仍处于缠绕状态。将pH调至中性并有高盐存在及低温的条件下，染色体DNA、大分子量的RNA和蛋白质在SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍然为可溶状态。通过离心，可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，最后用酚、氯仿抽提纯化得到质粒DNA。,1.将1.5ml过夜培养菌液放于EP管中，10000r/min离心1分钟，弃去上清液。2.加100l溶液，剧烈震荡使菌体悬浮均匀，室温放置5分钟。3.加200l溶液（现配现用），轻柔颠倒混匀46次，室温放置5分钟。4.加入150l预冷的溶液，轻柔颠倒混匀46次，冰上放置10分钟。,操作过程,溶液I：50mmol/L葡萄糖25mmol/LTris-Cl，pH8.010mmol/LEDTA，pH8.0溶液II：0.2mol/LNaOH1%SDS溶液III：29.4g乙酸钾，11.5ml冰乙酸，H2O至100ml。,5.12000r/m离心15分钟(如果上清液仍然浑浊，可将上清液移出，再次离心5分钟）。将上清液转移至EP管中，加等体积酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）抽提一次（12000r/min离心10分钟）。6.吸出上清液，加2.5倍体积的无水乙醇，混匀，室温放置10分钟，12000r/min离心10分钟，沉淀DNA。7.70%乙醇洗涤沉淀2次，自然挥干。8.所得DNA溶于3050lTE中，-20保存备用。,操作过程,TE溶液：