荧光定量PCR技术临床应用.ppt

荧光定量PCR技术在临床医学研究中的应用及注意事项,内容提要,一、基因诊断技术在医学检验中的地位二、荧光探针定量PCR在临床医学中的应用三、荧光探针定量PCR在临床医学中的主要问题,基因诊断的物质基础及与其它诊断方法的区别,基因诊断,免疫学诊断,临床诊断,细胞膜,细胞核,DNA,转录,mRNA,翻译,蛋白质,临床表现,生化诊断,临床实验医学发展,三个时代标志技术性质生化诊断时代生化分析表象免疫学诊断时代酶免、放免表象分子(基因)诊断时代基因体外扩增(PCR)本质,1、病原体的定量检测及药物疗效考评（HBV）2、肿瘤基因和肿瘤标志物表达(mRNA)的检测（P53）3、遗传病基因的检测（地中海贫血）4、与疾病相关的各种蛋白质的基因表达的定量检测6、建立病原体的分子诊断标准,荧光定量PCR在临床医学中的应用,荧光定量PCR在病原体检测中的应用,一、肝炎病毒定量检测二、性病病原体检测三、优生优育相关项目检测四、结核杆菌及呼吸道病原体检测五、其他病原体检测,病毒性肝炎概况,病毒性肝炎是由多种肝炎病毒引起，以肝脏炎症和坏死病变为主的一组传染病。按病毒的生物学特征、临床和流行病学特征，1989年在日本东京的国际肝炎学术讨论会上，将其分为甲（A）型、乙（B）型、（C）型、丁（D）型、戊（E）型肝炎，以后还报道了己（F）型和庚（G）型。我国是个肝炎大国，病毒性肝炎发病数位居法定管理传染病的第一位，仅乙型肝炎病毒感染者就达1.2亿，每年新增加的感染者也在百万以上，丙肝发病率亦趋上升。慢性乙型肝炎病程迁延，如得不到及时的治疗，部分将会发展为肝硬化甚至肝癌，严重危害人类健康。,HBV基因型与血清型关系及流行病学分布,病原学,乙型肝炎检测标志物,HBsAg，抗-HBsHBeAg，抗-Hbe抗HBcHBV-DNA,乙型肝炎免疫检测和PCR结果异同,“大三阳”PCR结果阴性抗-HBs阳性，PCR结果阳性,荧光定量PCR技术对性传播疾病的检测,一、淋球菌（NGH）二、沙眼衣原体、解脲脲原体（CT、UU）(有证）三、梅毒螺旋体（TP）四、单纯庖疹病毒（HSV）五、乳头瘤病毒（HPV）（有证）六、人类免疫缺陷病毒（HIV）,PCR技术对性传播疾病检测的注意事项,1标本的选取TPHSV2临床疗效考评,超高倍,荧光定量PCR诊断TORCH综合征,传统的TORCH病原体：TOX,other,RV,CMV,HSV新近发现的TORCH：麻疹V、腮腺炎V、水痘带状庖疹V、肠道V、乙肝V、丙肝V、HPV、EBV、HIV、人庖疹V6、人微小病毒B19等,TORCH感染的实验室诊断,一、组织培养：慢，费力，阳性率低二、血清学诊断：IgG：IgM：1、不能定量分析2、抗体的产生受多种因素的影响3、产生假阳性三、基因诊断方法原理：检测TORCH病原体的核酸优点：1、客观指标2、敏感性、特异性高3、定量指标荧光定量PCR在TORCH诊断中的应用：1、筛选TORCH的患者2、建立TORCH的分子诊断标准,荧光定量PCR技术检测TOX,孕妇TOX感染的危害孕早期（多少，也可对样本稀释后再检测；如低于此范围，则报告多少，如103拷贝数/ml，而不能报告为0拷贝数/ml或阴性。拷贝数与病原体的关系：拷贝数与病原体的数量成正相关。一般来说细菌是多拷贝的，病毒是单拷贝的。DNA拷贝数单位和质量单位：100拷贝HBV0.04fg国际单位IU,拷贝数/ml的确定：,DNA/RNA参考品（质粒等）,测量OD260的值得到mg/ml,通过与分子量的计算，得到拷贝数/ml,不同实验室得到的结果差别很大。,HCV国际单位与拷贝数换算,NGISuperQuant:1IU/mL=3.4copies/ml(NGIProductLicenseApplicationtoFDA)RocheAmplicorMonitorv2.01IU/mL=0.9copies/ml(RocheMolecularSystems)CobasAmplicorMonitorHCVv2.01IU/mL=2.7copies/ml(RocheMolecularSystems)LCxHCVRNAQuantitativeAssay1IU/mL=3.8copies/ml(AbbottDiagnostics)BayerbDNA3.0:1IU/mL=5.2copies/ml(BayerDevelopmentGroup),未知HCVRNA样本,甲实验室5000拷贝/ml,乙实验室10000拷贝/ml,丙实验室50000拷贝/ml,丁实验室20000拷贝/ml,实验室结果的互通性,20000IU/mlHCVRNA样本,甲实验室40000拷贝/ml1IU/ml2拷贝