柠檬酸液态发酵及提取工艺

CentralLaboratoryofBiology,柠檬酸液态发酵及提取工艺,综合大实验,任课教师：胡远亮,2011.6,性质,柠檬酸(citricacid)又名枸(j)橼酸，学名2-羟基丙烷三羧酸（2-hydroxytricarboxylicacid）或2-羟基丙烷-l，2，3-三羧酸（2-hydroxypropane-1，2，3-triearboxylicacid）。分子式、结构式：C6H8O7H2O溶解度：600g/L(20)酸性：1%柠檬酸的水溶液：pH2.2,理化性质,物理性质商品柠檬酸有两种形式：一种为无色透明，有光泽的含一个结晶水的晶体，其分子式为C6H8O7H2O，相对分子质量为210.14。另一种为无色半透明全对称晶体的无水柠檬酸，分子式为C6H8O7，相对分子质量192.13。无臭、味极酸、易溶于水和乙醇，水溶液显酸性。化学性质柠檬酸是一种较强的有机酸，有3个H可以电离；加热可以分解成多种产物，与酸、碱、甘油等发生反应。,1893年前，人们主要从柑橘、菠萝和柠檬等果实中制取柠檬酸。柠檬4080g/kg；柚子1221覆盆子1013；红醋栗1530草莓68；番茄2.51893年后发现微生物可产生柠檬酸，1951年美国Miles公司首先采用深层发酵法生产柠檬酸。我国在20世纪40年代初期开始浅盘发酵生产柠檬酸，60年代开始采用薯干粉直接深层发酵法。,来源,用途,柠檬酸因无毒、水溶性好、酸味适度、易被吸收和价格低廉等优点，被广泛应用于食品、医药、化工、化妆品、清洗(洗涤)、建筑等工业部门。其中食品和饮料业占56，清洗(洗涤剂)业占20，医药和化妆品占11，其他工业占13。柠檬酸在食品工业上广泛用作酸味剂、增溶剂、缓冲剂、抗氧化剂、除腥臭剂、螯合剂等。医药工业上广泛用柠檬酸及其盐类，柠檬酸盐用于补充相应的元素时，具有溶解度高、生理宽容性大，酸根直接被吸收而无积留等优点。柠檬酸及其盐类和衍生物在化学工业中广泛用作缓冲剂、催化剂、激活剂、增塑剂、螯合剂、清洗剂、吸附剂、稳定剂、消泡剂。柠檬酸及其盐类在印染、原子能工业、石油开采、建筑工业、铸造工业、皮革工业等行业中也有广泛的用途。,产量价格,2001年一水柠檬酸、无水柠檬酸年均价格为727美元/吨，比上年下降了13.1%。2002年16月份平均价格仅为670美元/吨，导致了出口数量虽然有少量增加，但是出口创汇却大幅度下降。,产柠檬酸的菌种,能够产生柠檬酸的微生物很多，青霉、毛霉、木霉、曲霉、葡萄孢菌及酵母中的一些菌株都能够利用淀粉质原料或烃类大量积累柠檬酸。最具商业竞争优势的是采用黑曲霉、文氏曲霉和解脂假丝酵母等菌种的深层液体发酵。目前国内外普遍采用黑曲霉的糖质原料发酵生产柠檬酸。,1)黑曲霉（Aspergillusniger）的形态特征在固体培养基上，菌落由白色逐渐变至棕色。孢子区域为黑色，菌落呈绒毛状，边缘不整齐。菌丝有隔膜和分枝，是多细胞的菌丝体，无色或有色，有足细胞，顶囊生成一层或两层小梗，小梗顶端产生一串串分生孢子。2)黑曲霉（Aspergillusniger）的生理特征黑曲霉生产菌可在薯干粉、玉米粉、可溶性淀粉糖蜜、葡萄糖麦芽糖、糊精、乳糖等培养基上生长、产酸。黑曲霉生长最适pH值因菌种而异，一般为pH37；产酸最适pH为1.82.5。生长最适温度为3337，产酸最适温度在2837，温度过高易形成杂酸。黑曲霉以无性生殖的形式繁殖，具有多种活力较强的酶系，能利用淀粉类物质，并且对蛋白质、单宁、纤维素、果胶等具有一定的分解能力。黑曲霉可以边长菌、边糖化、边发酵产酸的方式生产柠檬酸。,黑曲霉,三羧酸循环,EMP,丙酮酸羧化酶（在细胞质中）,苹果酸酯脱氢酶（在细胞质中）,柠檬酸酯合成酶（在细胞质中）,柠檬酸酯/苹果酸酯反向转运系统（线粒体膜）,黑曲霉内的柠檬酸合成,柠檬酸生物合成的代谢调节,糖酵解及丙酮酸代谢的调节磷酸果糖激酶：第一个关键酶，在正常情况下，柠檬酸、ATP对磷酸果糖激酶有抑制作用，而ATP、无机磷、NH4+对该酶则有激活作用，且能解除柠檬酸、ATP对磷酸果糖激酶的抑制作用。比较底物锰充足、锰缺乏时分批培养物的最大活力时发现，锰缺乏时黑曲霉的组成（合成）代谢受损伤，这与柠檬酸的积累有关。丙酮酸激酶：第二个调节酶，NH4+、K+有激活作用。黑曲霉合成柠檬酸的调节TCA环的起始酶，柠檬酸合成酶：调节酶。但在黑曲霉中，柠檬酸合成酶没有调节作用。第二个特点：黑曲霉菌体内-酮戊二酸脱氢酶缺失或活力很低（TCA环被阻断）。,Mn2+缺乏抑制蛋白合成NH4由于丙酮酸羧化酶是组成型酶，不被调节控制。丙酮酸氧化脱羧生成乙酰CoA和CO2的固定两个反应的平衡，以及柠檬酸合成酶不被调节，增强了合成柠檬酸的能力。由于顺乌头酸水合酶在催化时建立了以下平衡：柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬酸=90：3：7控制Fe2+含量时，顺乌头酸酶活力降低，使柠檬酸积累。随柠檬酸积累，pH降低到一定程度时，顺乌头酸酶和异柠檬酸脱氢酶失活，更有利于柠檬酸的积累及排出胞外。,柠檬酸积累的原因,中国柠檬酸行业的生产基本上采用以淀粉质为原料进行深层发酵，以钙盐法进行粗提取，再进行离子交换精制得出成品。传统的柠檬酸生产方式能源消耗高、资源浪费大、污染严重。虽然通过行业的努力，先后进行过萃取法、离子交换法等提取新工艺的探索，但要真正实现规模化生产还有一段距离。,主要原料,柠檬酸发酵工艺,1材料与方法,1.1材料菌种：黑曲霉；原料：玉米粉、麸皮；试剂：-淀粉酶、碳酸钙、硫酸、NaOH、DNS等。1.2仪器设备试管、三角烧瓶、茄子瓶、培养皿、1mL吸管、吸耳球、无菌涂棒、量筒；酒精灯、接种环、棉花、棉线、牛皮纸；天平、灭菌锅、培养箱、摇床；小型板框过滤机、恒温水浴锅、搅拌机、离子交换柱、旋转蒸发器、恒温干燥箱。,1.3培养基,斜面种子培养基（马铃薯琼脂培养基）去皮马铃薯200g切成小块，加水约500mL，煮沸30min，然后用纱布过滤，滤液加蔗糖20g，琼脂20g溶化后自来水定容至1000mL，分装于经干热灭菌后的带棉塞试管内，121灭菌20min，取出摆斜面。马铃薯液体培养基：不加琼脂，25ml/250ml三角瓶。,A含麸皮的查氏培养基(g/L)：蔗糖30；KNO31.0；K2HPO41.0；MgSO47H2O0.5；KCl0.5；FeS047H2O0.01；调节pH7.07.2，加水定容至1000mL，添加800g麸皮，拌匀至无干粉又无结团，分装入810个500mL三角瓶中，塞入8层纱布并包扎好。121灭菌30min，趁热摇散。B麸曲培养基：取新鲜麸皮，用60目筛子筛去细粉，按麸皮：水：1：(1.01.3)比例加水，拌匀至无干粉又无结团，或用水洗麸皮表面，挤去水分至有水感而水不下滴为宜。上述麸皮装入500mL三角瓶中，每瓶装80100g湿料，塞入8层纱布并包扎好。121灭菌30min，趁热摇散，冷却。,一级种子(麸曲种子)培养基,种子与发酵培养基,2325玉米粉调浆,加-淀粉酶，75，pH7.0-7.5，加Ca(OH)2（蛋白质沉淀），9095保温，调节pH5.2（DE值达25）;过滤，得淀粉水解糖液，配渣。取细度为60目以上的玉米粉300g装入2000ml烧杯中，加入1000mL水和78个单位-淀粉酶(高温)/g玉米粉；于80液化l0min后，继续加热至90保温30min，碘检不变色后，再加热到100煮沸(5l0min)，趁热经过二层纱布过滤；滤液加水冷却并调整糖度至1520和蛋白质含量不超过4g/L，取过滤清液50ml或100mL分别装入500mL三角瓶中，瓶口塞入8层纱布包扎好，1211520min。,1.4方法,1.4.1种子制备方法一：斜面种子制备：用接种环挑取冰箱保存的斜面菌种一环于斜面培养基上，于35恒温箱中培养35d，待长满大量黑色孢子后，即为活化的斜面种子。孢子悬浮液的制备：用无菌移液管吸取5mL无菌水至黑曲霉斜面上，用接种环轻轻刮下孢子，装入含有玻璃球的三角瓶中，盖好塞子振荡数分钟。每支斜面的孢子悬浮液可接23瓶麸曲三角瓶。吸取孢子悬浮液2mL接入上述麸曲种子培养基中，然后摊开纱布、扎好，并在掌心轻轻拍三角瓶，使孢子与培养基充分混合，于3032下恒温培养1d后，再次拍匀，于35下培养，每隔1224h摇瓶一次，孢子长出后停止摇瓶，这样继续培养34d，即成种曲。,种子制备方法二,接种：用无菌水将麸曲孢子制成孢子悬液，按1接种于摇瓶中；接种量：一支斜面接45瓶，摇瓶培养：八层纱布盖口，回旋式摇床，38，100转/min培养20h；或35下、转速200r/min(24h前l00，24h后200r/min)、300r/min(24h前l00，24h后300r/min)，培养34d。镜检：显微镜观察，处于快速生长期，可用于接种。,1.4.2发酵液预处理,取细度为60目以上的玉米粉300g装入2000ml烧杯中，加入1000mL水和78个单位-淀粉酶(高温)/g玉米粉；于80液化l0min后，继续加热至90保温30min，碘检不变色后，再加热到100煮沸(5l0min)，趁热经过二层纱布过滤;滤液加水冷却并调整糖度至1520和蛋白质含量不超过4g/L，pH6.0。取过滤清液50mL分别装入500mL三角瓶中，瓶口塞入8层纱布包扎好，于121灭菌1520min，冷却备用。,1.4.3发酵,为两个阶段：第一阶段为前24h，温度3235，转速100r/min；第二阶段为24后，温度35，转速200r/min；发酵0、24、48、72、96h取样，0h样品直接取1瓶作对照，并从中取10ml冷冻保存。其它时间取样时，每个样品仅取1ml冷冻保存，取样时用试纸现场检测pH值。,1.4.4发酵过程及分析,样品80水浴30min，3000r/min，10min离心去掉菌体等杂质，收集上清，作检测，如果检测样品量不够，可对上清进行适当倍数稀释；柠檬酸含量检测：一般检测发酵过程中的总酸，采用0.1429molLNaOH溶液滴定上清液；总糖及残糖(还原糖)采用测定：试剂或DNS法，测上清的总糖。,1.4.5柠檬酸提取,过滤：加热至652，3层纱布过滤，可用少量752水洗；离心：3000r/min，10min离心去掉菌体等杂质；水洗：752水洗至柠檬酸1；,中和,滤液中除含柠檬酸外，还含可溶性的残糖以及蛋白质、金属离子等杂质。利用柠檬酸钙难溶于水的特点，与杂质分离；将经过沉淀的清液移入烧杯，加热至7075，加入碳酸钙中和，边加边搅拌，至pH6.1（每100g柠檬酸需加入71.4g碳酸钙，一定要控制好终点），终点可用NaOH滴定，或直接测定pH值，此时柠檬酸呈钙盐析出；加完碳酸钙后，升温到90，保持0.5h侍碳酸钙反应完成后，沉淀10min，吸去残酸，脱水，用95以上的热水洗涤钙盐，以除去表面附着的杂质和糖分。在这里要重点检查糖分是否洗净，方法是将12%的高锰酸钾溶液滴一滴到20毫升洗水中，3min不变色即说明糖分已基本洗净；脱水，收集柠檬酸钙。,酸解,酸解是将已洗净的难溶性的柠檬酸钙与硫酸作用，生成柠檬酸与硫酸钙。反应式如下：Ca(C6H5O7)2+3H2SO4=2C6H8O7+3CaSO4柠檬酸钙用水稀释成糊状，慢慢加入硫酸（用量为碳酸钙的8595%为宜），加热至90反应30分钟，至pH1.51.8，生成柠檬酸和硫酸钙沉淀；在加入计算量的80%以后，即要开始测定终点。方法如下：取甲乙两支试管，甲管吸取20%H2SO41ml，乙管吸取20%CaCl21ml，分别加入1毫升过滤后的酸解液，水浴加热至沸，冷却后观察两管溶液，如果不产生混浊，再分别加入1ml95%酒精，如甲乙两管仍不呈混浊，即认为达到终点。过滤、洗酸：滤液含较纯的柠檬酸，真空抽滤，90热水洗沉淀至无酸；,脱色,在所得清液中，加入活性炭（一般用量为柠檬酸量13%，视酸解液的颜色而定）脱色，在85左右保温30min，即可过滤。滤瓶用85以上热水洗涤，洗至残酸低于0.30.5即可结束，洗水单独贮放，作为下次酸解时的底水使用。,1.4.6柠檬酸精制,离子交换：阳离子交换：主要除钙离子、铁离子；终点控制，黄血盐检验铁；阴离子交换：主要除硫酸根、氯离子；终点控制，AgNO3检验Cl-，BaCl2检验SO42-。蒸发浓缩：旋转蒸发器，5060；终点控制，比重：1.3451.36或达36.737波美度时即可。结晶分离：分批冷却结晶；36.5，12h，过滤、分离。干燥包装：真空干燥器35以下干燥，质检、装袋、封口。,2结果,2.1种子的制备记录黑曲霉在斜面，麸皮培养基，摇瓶培养基中的形态特征。摇瓶取样检测黑曲霉形态；2.2发酵液预处理发酵液糖含量；发酵液总量；2.3发酵过程控制温度控制数据；,2.4取样及分析,记录各项测定指标及数据,平均耗糖速率(g/h)：单位时间内黑曲霉消耗糖(还原糖)的克数。平均柠檬酸生成速率（g/h）：单位时间内黑曲霉生成柠檬酸的克数。糖酸转化率()：黑曲霉生成柠檬酸的克数与消耗糖(还原糖)的克数之比的百分数。,3讨论,种子的制备：黑曲霉活化的目的；发酵液预处理：为什么要对原料进行预处理，预处理的方法有哪些；在柠檬酸生产中，如果利用木署为原料，应该如何处理；发酵过程控制：柠檬酸积累的原因；取样