流式细胞技术应用

流式细胞术原理及在中医药研究中应用简介,湖北中医药大学中医药实验中心 田代志,流式细胞术发展史,1930年Caspersson和Thorell开始致力于细胞计数的研究1934年Moldaven最早设想细胞检测自动化，用光电仪记录流过一根毛细管的细胞1940年Coons提出结合荧光素的抗体去标记细胞内的特定蛋白1949年Wallace Coulter申请了在悬液中计数粒子的方法的专利1950年Caspersson用显微UV-VIS检测细胞,流式细胞术发展史,1953年Croslannd-Taylor应用分层鞘流原理，成功设计红细胞光学自动计数器1969年Van Dilla及其同事在Los Alamos, NM发明第一台荧光检测细胞计1972年Herzenberg研制出细胞分选器1975年Kohler等提出单克隆抗体技术，为细胞研究提供大量的特异免疫试剂大量厂家不断生产流式细胞仪,流式细胞术发展史,目前国内主要流式细胞仪厂家：Beckton Dickinson(BD)公司BACKMAN COULTER公司,流式细胞仪构造,流式细胞仪(Flow Cytometer，FCM)的结构分五部分：流动室及液流驱动系统激光光源及光束成形系统光学系统信号检测与存贮、显示、分析系统细胞分选及浓缩系统流式细胞术(Flow Cytometry，FCM)图示如下页：,流式细胞仪构造模式图,流式细胞仪构造示意图,流动室与液流驱动系统,流动室是仪器核心部件，被测样品在此与激光相交。流动室由石英玻璃制成，中央有一长方形小孔，供单个细胞通过。流动室内充满了鞘液，其作用是将样品环形包绕。鞘液流速稳定，样品流在鞘流的环包下形成流体动力学聚焦，从而得到准确的细胞荧光信息。流动室上装有压电晶体，受到振荡信号可发生振动。,流动室与液流驱动系统,激光光源及光束成形系统,目前台式机FCM，大多采用氩离子气体激光器。激光光束在到达流动室前，先经过透镜聚焦，形成约2266m的光斑，这样激光能量较强，以激发荧光染料。台式机的整个光路是封闭的，在安装时由工程师调试完毕后，无需用户作任何调节，使用十分方便。,激光光源及光束成形系统,光学系统,FCM的光学系统由若干组透镜、滤光片和小孔组成，它们将不同波长的荧光信号分别送入到不同的电子测控器。主要光学原件：滤光片(Filter)长通滤片 Long Pass Filter, LP短通滤片 Short Pass Filter, SP带通滤片 Band Pass Filter, BP,长通滤片,短通滤片,带通滤片,信号检测与分析,当细胞携带荧光素标记物，通过激光照射时，产生代表细胞内不同物质、不同波长的荧光信号，这些信号以细胞为中心，向空间360度立体角发射，产生散射光和荧光信号。以激发光光源波长488nm为例示意图：,荧光信号示意图,散射光信号,散射光信号不依赖任何样品的制备技术（如染色），因此称为细胞的物理参数。前向散射角(Forward Scatter，FSC)：与细胞的大小有关，在FCM应用中，常取FSC作阈值，来排除样品中的各种碎片。侧向散射角(Side Scatter，SSC)：与激光束正交90度的散射光信号，与细胞粒度及复杂程度正相关。散射光信号波长与激光相同。,散射光信号示意图,荧光信号,一种是细胞自身在激光照射下发出微弱的荧光信号，称自发荧光。一种是经过特异荧光素标记后，受激发光照射得到的荧光信号，通过对这类荧光信号的检测和定量就能了解所研究细胞参数的存在与定量。,常用荧光染料,目前台式机FCM配置488nm激光管常用染料有PI (Propidium Iodide)PE (Phycorey- thrin)FITC (Fluorescein Isothiocyanate)PerCP (Peridinin Chlorophyll Protein)PE-CY5等633nm激光管常用染料有APCAPC-Cy,FCM测量数据的存贮、显示和分析,目前FCM所采用的都是多参数指标，荧光参数标记物最多可达4个，数据的存贮采用列表排队方式，可节省存贮空间。数据文件为二进制文件，缺乏直观性，数据的显示常用以下几种方式：直方图散点图等高线图密度图三维图,直方图,直方图(Distribution Histogram)横坐标代表荧光信号或散射光信号相对强度，单位是道数，可以是线性或对数坐标。纵坐标一般是细胞数。,散点图,散点图(Dot Plot)X坐标为该细胞一参数相对含量，Y坐标为该细胞另一参数的含量，可以将细胞亚群分开。,等高线图和密度图,三维图,设门分析,可以通过设“门” (Gate)，分析、分选感兴趣的细胞。,FCM的分辨率,分辨率是衡量FCM测量精度的指标，通常用变异系数CV表示。一般要求CV8，最好CV15% DNA倍体分析：结合临床病理的形态学诊断，对一些恶性肿瘤进行早期诊断，跟踪随访和早期治疗，大大提高一些肿瘤的治愈率和生存率。尤其对一些细胞抽吸物、体液、组织液的脱落细胞的分析，意义尤为重要。增殖状态分析：反映了肿瘤的生长速度和侵袭性,正常人骨髓细胞DNA分析(ModiFIT),多发性骨髓瘤,FCM在肿瘤早期诊断和鉴别诊断中的作用,DNA非整倍体的出现可能是癌前病变发生早期癌变的一个重要标志在病理形态学不能做出诊断前可提供确切诊断信息DNA非整倍体的交界瘤应按恶性对待形态学表现良性的肿瘤出现非整倍体提示恶变可能DNA指数可作为判断间叶组织肿瘤良恶性的辅助指标,细胞凋亡分析,细胞凋亡与细胞坏死是两个不同的过程细胞凋亡的主要检查手段形态学检测Ladders实验流式细胞术检测与凋亡相关的病理过程HIV自身免疫性疾病肿瘤,细胞凋亡分析,细胞凋亡的主要指标细胞内酶改变：Caspase-3活化细胞膜不对称性改变，磷脂酰丝氨酸外翻，但仍然保持膜的完整性：Annexin V/PI细胞核DNA的断裂改变：TUNNEL实验（APO-BRDU，APO-DIRECT）凋亡相关蛋白：FasBcl-2,细胞凋亡PI分析,细胞凋亡Active Caspases-3,细胞凋亡Caspases-3,细胞凋亡Annexin V,细胞凋亡Annexin V,细胞凋亡BrdU,FCM的应用免疫学,淋巴细胞免疫分型淋巴细胞亚群分析CD4绝对计数HIV的诊断与研究淋巴细胞 CD4/CD8分析CD4绝对计数T细胞活化细胞移植的交叉配型和免疫状态监测,FCM的免疫学应用,免疫功能和免疫调控的研究淋巴细胞和单核细胞的活化细胞因子的研究淋巴细胞的增殖树突状细胞的研究HLA-B27检测,淋巴细胞亚群分析,使用特异的单克隆抗体，进行多色分析，同时分析淋巴细胞上多种抗原的表达，可以将淋巴细胞亚群区分开，进行定量分析各淋巴细胞亚群的百分含量淋巴细胞亚群的绝对计数,临床意义,了解在不同情况下体内免疫功能状态辅助临床疾病的诊断探索疾病的发病机理、病程、预后监测、指导临床治疗方案免疫系统疾病免疫缺陷病，AIDS移植病人排斥反应或移植物抗宿主反应的检测肿瘤病人化疗后免疫力检测,淋巴细胞亚群分析,根据功能，淋巴细胞主要分为B淋巴细胞（CD19+），与体液免疫有关T淋巴细胞（CD3+），与细胞免疫有关总T和总B可以用来判断某些免疫缺陷和自身免疫性疾病 NK细胞（CD3- CD16+ 56+），行使免疫监控功能，能够介导对某些肿瘤细胞和病毒感染细胞的细胞毒性作用。,SimulTEST IMK-Lymphocyte 试剂盒,CD45/CD14，Leucogate：确定淋巴细胞门，评估门的有效性，并自动计算淋巴细胞亚群占门内淋巴细胞的比例，排除门内杂细胞的干扰1/2a，阴性对照：确定淋巴细胞的阴性界值，评估实验的非特异染色CD3/CD19：分析T淋巴细胞和B淋巴细胞CD3/CD4：分析T辅助/诱导细胞CD3/CD8：分析T抑制/细胞毒性细胞CD3/CD16+56：分析T淋巴细胞和NK细胞,淋巴细胞双色分析,LeucoGATE：Back-Gating，准确圈定淋巴细胞门，并评估门的有效性,淋巴细胞双色分析,AIDS病人T细胞亚群分析,FCM的应用血液病学,白血病和淋巴瘤免疫分型残留白血病造血干细胞计数PNH诊断网织红细胞分析血小板分析血小板膜糖蛋白分子的表达血小板活化网织血小板分析,FCM的应用分子生物学,分选细胞后进行FISH分选细胞后进行PCR流式细胞免疫表型与聚合酶链反应及荧光原位杂交（PCR-FISH）结合测定血液CD4细胞中HIV特异的DNA或RNA流式荧光原位杂交（Flow-FISH）测定染色体端粒长度,性别选择,FCM在中医药研究中的应用,我科室开展较多的有如下几个方面的应用：中药对肿瘤细胞的细胞周期及凋亡影响，抗肿瘤中药成份的筛选中药对细胞表面（细胞因子、激素）受体表达的影响中药对细胞粘附分子表达的影响中药对淋巴细胞亚群（反映免疫状态）的影响针灸及中药对细胞内酶的表达影响中药对生精细胞的影响研究中药治疗艾滋病的研究（我实验室仅提供技术支持）,本实验室流式细胞仪及应用介绍,生产厂家：美国BECTON DICKINSON(BD)公司 型号：FACSCalibur 激光器：488nm和633nm各一个 荧光通道（共4通道6参数） FSC及SSC：480-495nmFL1：515-545nm FL2：564-606nmFL3：670nm FL4：653-667nm技术参数分析速度10000个/秒，分选速度700个/秒。常用荧光染料光谱学特征,细胞周期分析PI单染,细胞周期分析PI单染,细胞周期分析ModiFit 分析,细胞周期分析ModiFit 分析,大鼠生精细胞分析PI单染,细胞凋亡PI加Annexin V双染,FITC-Annexin V,PI,淋巴细胞亚群分析,CY5.5-CD3,FITC-CD4,PE-CD8,培养细胞表面粘附分子表达,培养细胞表面粘附分子表达,FCM样品来源,需要制备细胞悬液血液、体液等液体样品培养的细胞活体组织样品冰冻组织固定的组织样品,直接应用分离后使用,样品制备,细胞分离方法直接离心沉淀物理方法分离（超声波、筛网等）酶消化如果是固定的组织，先脱蜡，再用物理或化学方法分离,样品染色步骤,PBS洗细胞12次加（荧光）单抗，暗处孵育1530分钟如果必需，加荧光二抗，暗处孵育1530分钟PBS洗细胞一次过300目尼龙网上机检测,PI单染测细胞凋亡步骤,制备细胞悬液PBS洗细胞1次，1000rpm离心10min，去上清。加PI染液（含PI 50mg/ml, Rnase 5