酵母发酵法制备超氧化物歧化酶

.,酵母发酵法制备超氧化物歧化酶,.,SOD的用途,SOD在食品工业中，作为保健食品的功效因子或食品营养强化剂，该保健品具有良好的抗衰老、抗炎、抗辐射、抗疲劳等保健强身的效果。目前已有添加SOD的蛋黄酱、牛奶、可溶性咖啡、啤酒、白酒、果汁饮料、矿泉水、奶糖、酸牛乳、冷饮类等类型的保健食品面市。制成多种剂型的SOD或复合型食品。已有SOD胶囊剂、片剂、口服液、脂质体、颗粒剂等形式的SOD保健食品。SOD可作为罐头食品，果汁、啤酒等的抗氧剂，防止过氧化物酶引起的食品变质及腐败现象。此外，还可作为水果、蔬菜的保鲜剂。研究证实，SOD添加于化妆品中可起到四方面的作用：一是有明显的防晒效果；二是SOD作为抗氧化酶能有效防止皮肤衰老、祛斑、抗皱；三是有明显的抗炎效果，对防治皮肤病有一定效果；四是SOD具有一定的防治瘢痕形成的作用。,.,SOD的使用现状,自1969年McCord和Fridovich首次从牛红细胞中分离出超氧化物歧化酶（SOD）以来，人们相继从牛、猪、羊、马等动物红细胞、肌肉、肝脏组织以及植物中分离和纯化出SOD。国外已有多种药用SOD应用于临床，主要集中在抗炎、抗辐射、抗肿瘤、抗衰老老及由超氧阴离子自由基引发疾病自身免疫性疾病等。目前，国内SOD的应用主要集中在食品和化妆品等方面，在吸收机制质量稳定性、有效性等方面的基础研究取得一些新进展。国内现有SOD产品主要是从牧畜血液中提取，发酵法生产还未产业化。,.,SOD性质,超氧化物歧化酶是广泛存在于动物、植物及微生物细胞内的金属酶，至少可分为三种类型：Cu，Zn-SOD、Fe-SOD、Mn-SOD。该酶系一种酸性蛋白质，较稳定，能耐热。pH7.69时稳定，pH6以下和12以上不稳定，pH2以下极度不稳定。具有较强的抗胃蛋白酶和胰蛋白酶水解的能力。,.,工艺流程,.,工艺简要介绍,发酸罐中发酵培养：平皿上挑取取H2O2性能好的单个菌落，经斜面培养、液体培养（一级）、扩大培养（二级）后，按10%的量接入发酵罐（2L）中通气培养。每隔2h取样一次，于650mm处测定发酵液的OD值，当OD值恒定而有下降趋势时，放出发酵液，离心收集菌体供提取SOD。酵母菌中SOD的提取及纯化：将离心分离得到的酵母菌体，悬浮于缓冲液（50mM磷酸钾缓冲液，0.3M海藻糖，10M氯化镁，pH7.07.5）中，用蜗牛酶酶解后，超声波破碎细胞壁，菌体碎片再用DNase酶酶解，离心除去残渣，得粗酶提取液；在搅拌下加入乙醇-氯仿（53）溶液，离心除去杂蛋白；再加入磷酸氢二钾盐析；上清液加入0.75倍冷丙酮，冷冻离心得粗酶沉淀；将沉淀溶于pH7.8磷酸钾（2.5mM）缓冲液中透析12d，即得Cu，Zn-SOD酶液。,.,个别试剂用途解释,0.3M海藻糖：本来是0.5M的蔗糖的，但经过查找文献，发现不同浓度的海藻糖对SOD均有较强的保护作用，其中浓度在0.3mol/L时效果最佳，而蔗糖对SOD既无激活作用也没抑制作用，所以改成了海藻糖。DNaseI：即DeoxyribonucleaseI，中文名称为脱氧核糖核酸酶I，是一种可以消化单链或双链DNA产生单脱氧核苷酸或单链或双链的寡脱氧核苷酸的核酸内切酶。DNaseI水解单链或双链DNA后的产物，5端为磷酸基团，3端为羟基。10M氯化镁溶液：是DNaseI激活剂。DNaseI活性依赖于钙离子，并能被镁离子或二价锰离子激活。镁离子存在条件下，DNaseI可随机剪切双链DNA的任意位点。蜗牛酶：是从蜗牛的嗦囊和消化道中制备的混合酶，它含有纤维素酶，果胶酶，淀粉酶，蛋白酶等20多种酶。蜗牛酶是很有价值的一种酶。它可以用于酵母细胞壁的破碎,.,SOD酶活力测定,在一般情况下，SOD活性测定只能应用间接活性测定法。其测定方法很多，常见的有化学法、免疫法和等电点聚焦法。其中化学法应用最普遍，化学法的原理主要是利用有些化合物在自氧化过程中会产生有色中间物和O2-，利用SOD分解而间接推算酶活力。在化学方法中，最常用的有黄嘌呤氧化酶法，邻苯三酚法，化学发光法，肾上腺素法，NBT-还原法，光化学扩增法，Cyte还原法等。其中改良的邻苯三酚自氧化法简单易行较为实用。本实验采用邻苯三酚自氧化方法。,.,邻苯三酚自氧化法原理,邻苯三酚在碱性条件下，能迅速自氧化，释放出O2-（超氧阴离子自由基），生成带色的中间产物（红桔酚），反应开始后反应液先变成黄棕色，几分钟后转绿，几小时后又转变成黄色，这是因为生成的中间物不断氧化的结果。本实验中测定的是邻苯三酚自氧化过程中的初始阶段，中间物的积累在滞留3045s后，与时间成线性关系，一般线性时间维持在4min的范围内，中间物在325nm波长出有强烈光吸收。当有SOD存在时，由于它能催化O2-与H+结合生成O2和H2O2，从而阻止了中间有色产物的积累，导致吸光值下降因此，通过测定它们在特定波长下得光吸收变化速率计算出SOD的酶活性。,.,邻苯三酚O2-+红桔酚（自氧化：有色物质积累，吸光值增加）O2-+O2-+2H+H202+O2（SOD催化：阻止中间产物积累，吸光值降低）,pH=8.2,SOD,.,实验步骤,1测定邻苯三酚溶液自氧化速率：取两支试管按右表加入25预热过的缓冲液,然后加入预热过的邻苯三酚（空白管用10mmol/LHCl代替邻苯三酚），迅速摇匀，立即倾入1cm比色杯中，在325nm波长处测定光吸收值，每隔30s读数一次，测定4min内每分钟光吸收值的变化。要求自氧化速率控制在每分钟的光吸收值为0.070（可增减邻苯三酚的加入量，以控制光吸收值）。,.,2.SOD样液活力测定：样品管取代自氧化管。样品管测定时先加入预热