常用分子克隆工具酶简介.ppt

常用工具酶简介,第一节DNA连接酶(DNAligase),1DNALigase1.1概念1.2分类根据连接反应时所需能量辅助因子的不同：依赖ATP的DNAligase依赖NAD+的DNAligase,按照来源分：T4噬菌体DNAligase大肠杆菌DNAligase热稳定DNAligase,2DNAligase简介2.1T4DNAligase连接类型：DNA-DNADNA-RNARNA-RNAdsDNA的黏性末端和平末端,2.2大肠杆菌DNAligasedsDNA的黏性末端和平末端,3DNAligase催化连接反应的特点3.1需要3-OH和5-P3.2需要ATP或NAD+和Mg2+为辅助因子和激活因子3.3被连接的是dsDNA3.4只能封闭缺口,4影响DNAligase连接反应的因素4.1温度黏性末端4-15平末端10-204.2连接酶浓度平末端1-2个单位黏性末端0.1个单位,4.3ATP浓度4.4DNA片段末端,第二节DNA聚合酶和反转录酶,DNA聚合酶：在引物和模板的存在下，把脱氧核糖单核苷酸连续地加到双链DNA分子引物链的3-OH末端，催化核苷酸的聚合作用。,1DNApolymerase分类,依赖于DNA的DNA聚合酶:EcoliDNApolymeraseIklenow片段T4phageDNAploymeraseT7phageDNAploymerase耐热DNA聚合酶(Taq酶)依赖于RNA的DNA聚合酶:反转录酶(reversetranscriptase),1.1EcoliDNApolymeraseI分类：DNApolIDNApolDNApol,DNApolI特性：5-3DNA聚合酶活性3-5外切酶活性5-3外切酶活性（切口平移）,1.2Klenow片段大肠杆菌DNA聚合酶I的枯草杆菌蛋白酶水解产物。活性：53聚合酶35外切酶,用途：3-末端补平3-末端抹平cDNA第二链合成双脱氧系统测序,3-末端补齐3-末端标记5-ACGTTGCAAACTG-33-TGCAACGTTTGAC.5cDNA第二链合成mRNA3-UGCAACGUUUGAC.5cDNA5-ACGTTGCAAACTGGAC,5,3,5,3,5,5,5,5,5,5,3,3,3,3,3,3,热变性,随机引物退火,-32PdNTPKlenow酶,5,5,5-,-5,1.3T4DNApolymerase特点：53聚合酶活性35外切酶活性,用途：补平反应末端标记抹平反应,1.4TaqDNApolymerase特点：分离自水生栖热菌，分子量为94,000，最适反应温度75-80。5-3聚合酶活性5-3外切酶活性用途：主要用于DNA的体外扩增,TaqPol和PCR,1.5反转录酶(reversetranscripase)用途：cDNA第一链的合成补平反应用于DNA测序,第三节DNA修饰酶,1.1末端转移酶（TdT）反应特点在酶的催化下将dNTP加到DNA分子的3OH末端，催化作用不需要模板。用途3-加尾，便于两DNA分子重组3-末端标记,1.2T4多聚核苷酸激酶催化反应：正向反应催化5-OH末端的磷酸化交换反应,1.2T4多聚核苷酸激酶用途：1)DNA或RNA的5末端标记2)分子克隆过程中以获得5-磷酸基末端，便于连接酶反应,1.3碱性磷酸酶用途1)载体DNA的去磷酸化，防止自我连接，以增加重组频率2)5端核酸末端标记,碱性磷酸酶与T4多聚核苷酸激酶活性,第四节外切核酸酶,1外切核酸酶概念2分类按照酶对底物二级结构的专一性，分为：作用于单链的外切核酸酶作用于双链的外切核酸酶,第五节单链内切核酸酶,1.1S1核酸酶特点：ss-DNA;ss-RNA;双螺旋变性区用途1)基因突变-缺失，常与外切酶，如ExoIII、外切酶、Bal31连用2)DNA定序分析3)S1作图法4)基因结构分析5)tRNA结构分析,S1核酸酶活性,1.2Bal31核酸酶对单链DNA具有特异的内切酶活性，可从3OH端降解DNA。对于L-DNA，它表现3-5的外切酶活性和5-3的外切酶活性，可又有控制地从3端和5端逐个水解除去单核苷酸，产生缩短了的DNA分子。,1.3DNaseI用途1)切口移位，制备DNA探针2)制备RNA样品时除去DNA分子3)基因突变时产生切口,ds-DNA结构:切口,缺口,断口,第六节RNA酶,1.1RNase,用途：在DNA制备时用于降解RNA分子去除DNA:RNA或RNA:RNA中没有杂合的RNA区域,1.2RNaseH,特异地降解DNA:RNA杂合链中的RNA部分，产生不同长度的具有3OH和5P端的寡核苷酸，它不能降解单链或双链的DNA（或RNA).,切平反应和补平反应,四种不同补平反应,5-GGATCC-3BamHI5-GGATCC-33-CCTAGG-53-CCTAGG-5dNTPdGTPdGTP/dATPdGTP/dATP/dTTP5-GGATC5-GG5-GGA5-GGAT3-CCTAG3-CCTAG3-CCTAG3-CCTAGGATCC-3GATCC-3GATCC-3GATCC