分子克隆技术的工具酶.ppt

第二章分子克隆技术的工具酶,1,分子克隆的工具酶（instrumentalenzymeofmolecularcloning）是应用于分子克隆中的各种酶的总称，包括核酸序列分析、标记探针制备、载体构建、目的基因制取、重组体DNA制备等所需要的酶类。,2,用于核酸操作的工具酶,限制性核酸内切酶,DNA聚合酶,DNA连接酶,核酸修饰酶,3,NMPNTPdNMPdNTP,4,5,一、限制性核酸内切酶（Restrictionenzyme）,核酸酶的分类1）根据核酸底物分RNA酶（Rnase）DNA酶（Dnase）底物非专一性核酸酶；2）根据作用方式分内切核酸酶（endonuclease）外切核酸酶（exonuclease）；3)根据对底物碱基专一性分碱基专一性核酸酶（切割部位的碱基序列高度专一性）非碱基专一性核酸酶（切割部位的碱基序列随机性）,6,核酸酶能够将核苷酸链的磷酸二酯键切断的酶，属于水解酶。,1.限制性核酸内切酶的发现及其生物功能,生物功能：识别双链DNA分子中的特定序列，并切割DNA双链；主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来DNA的入侵,发现：1968年，Smith等人首先从流感嗜血杆菌d株中分离出Hind和Hind,7,酵母中的限制性酶：SceI、Endo.SKI,限制-修饰系统限制作用：是指一定类型的细菌可以通过限制性核酸内切酶的作用，破坏入侵的外源DNA(如噬菌体DNA等)，使得外源DNA对生物细胞的入侵受到限制；修饰作用：生物细胞(如宿主)自身DNA分子通过甲基化酶的作用，在碱基特定位置上发生了甲基化，可免遭自身限制性内切酶的破坏。限制修饰作用实际就是细菌中的限制性内切酶降解外源DNA，维护自身遗传稳定的保护机制。,8,细菌中的防卫系统：限制与修饰现象（1）细菌在其感受态的生理条件下，很容易吸收外源DNA进入体内。这种感受态可以是人为的，也可以是在自然条件下发生的。如果细菌不加限制地接受所有的外源DNA，细菌本身就会很快发生遗传变异甚至死亡。（2）限制性核酸内切酶：可以帮助细菌限制外来DNA的入侵（3）甲基化酶：对该特异位点的碱基进行甲基化修饰，被修饰的DNA就不再被相应的限制酶切割了。（4）细菌自身的DNA受到甲基化修饰，得以保存（5）外源入侵的DNA未来得及甲基化，被降解,9,10,作为分子克隆宿主菌的大肠杆菌（如DH5），必须是（1）rec基因缺陷型的突变体，保证必须不与外来DNA分子发生遗传重组；（2）限制系统缺陷或限制与修饰系统均缺陷的菌株，保证外来DNA分子不会受其限制酶的降解。,11,2.限制性核酸内切酶的类型,主要特性I型II型III型,蛋白结构,异源三聚体,同源二聚体,异源二聚体,切割位点,距识别序列1kb处,识别序列内或附近,距识别序列下游,随机性切割,特异性切割,24-26bp处,SAM：S-腺苷蛋氨酸,12,型酶的作用方式在分子克隆中具有十分重要的价值，是分子克隆中常用的工具酶。型酶、型酶的使用不如型酶方便，切割方式不如型酶那样令人满意，在基因克隆中实用价值不大。,13,3.限制性核酸内切酶的命名,属名种名株名,HindHind,Haemophilusinfluenzaed嗜血流感杆菌d株,同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶,14,H：细菌属名的头一个字母in：细菌种名的头两个字母Hin：表示了该菌的物种名称，用斜体d：代表该菌菌株名称III：表示该菌具有几个不同的限制与修饰体系，表示该酶是属于第三个限制修饰系统的酶,15,4.II型限制性核酸内切酶的基本特性,（1）识别双链DNA分子中4-8对碱基的特定序列；,（2）大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧；,（3）识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构；,5GCTGAATTCGAG3,3CGACTTAAGCTC5,EcoR的识别序列,EcoR的切割位点,16,（1）回文结构（palindrome）序列正读和反读是一样的，即有一个中心对称轴，从这个轴朝两个方向读序列是完全一样的。在切割位点处，限制性核酸内切酶的作用下磷酸二酯键会发生水解效应，从而导致链的断裂。,17,（2）限制性核酸内切酶的切割类型：粘末端：两条链上的断裂位置是交错和对称围绕着一个对称轴排列，这种形式的断裂结果形成具有粘末端的DNA片段；平末端：两条链上的断裂位置是处在一个对称轴的中心，这样形式的断裂是形成具有平末端的DNA片段。,18,EcoR等产生的5粘性末端,EcoR37,退火4-7,5G-C-T-GA-A-T-T-C-G-A-G3,3C-G-A-C-T-T-A-AG-C-T-C5,OH,P,OH,P,磷酸二酯键发生水解,nick缺口,19,Pst等产生的3粘性末端,5G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G3,3C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C5,Pst37,5G-C-T-C-T-G-C-A-OHP-G-G-A-G3,3C-G-A-G-POH-A-C-G-T-C-C-T-C5,退火4-7,5G-C-T-C-T-G-C-AG-G-A-G3,3C-G-A-GA-C-G-T-C-C-T-C5,OH,P,OH,P,磷酸二酯键发生水解,nick缺口,20,Pvu等产生的平头末端,5G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G3,3C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C5,Pvu37,磷酸二酯键发生水解,21,限制酶的识别序列与DNA的来源无关，不带有种的特征，对各种DNA都普遍适用。因此，甲种生物的DNA与乙种生物的DNA用同一种限制酶作用后，所形成的限制片段带有同样的末端，能够通过碱基的互补配对而连接起来。这是重组DNA技术的重要基础之一。根据这一特性，可以将不同来源的DNA重组成一种新的重组体分子。限制酶切割DNA分子形成的短片段可以自发地重新连接成环状，这些环状分子经过加热又可以打开成线状。但如果在环化后加进DNA连接酶，在DNA片段之间的接口处将形成磷酸二酯键，这是一种较强的化学结合力，形成的环形DNA将是十分稳定的，即使再加热也很难再成线状，除非再次受到限制酶的作用。这说明，DNA经限制酶切割后再通过连接酶作用，得到的连接DNA是相当稳固的，这也是分子克隆技术的重要前提。,22,（3）位点偏爱（sitepreference）某些限制性内切酶对不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率。,23,（4）星号活性（staractivity）又称星活性，一些限制性内切酶在某些反应条件变化时酶的专一性发生改变，如甘油浓度过高、反应液离子强度过低、pH改变、有机溶剂的影响等条件，酶切割位点专一性发生改变。,24,（5）同裂酶(isoschizomers)有些来源不同的限制性核酸内切酶识别同样的核苷酸靶序列，切割位点可以相同，也可以不同。例如，XmaI（CCCGGG）SmaI（CCCGGG）,25,（6）同尾酶(isocaudamers)来源不同，识别的靶序列也各不相同，但都能产生相同的粘性末端，称为同尾酶。常用的BamH和Bgl是一组同尾酶，它们切割DNA之后都形成由“-GATC-”4个核苷酸组成的粘性末端。,26,5.II型限制性核酸内切酶酶解反应的操作,(1)大部分II型核酸内切酶需要相似的反应条件：,Tris-HCl,50mMpH7.5,MgCl2,10mM,NaCl,0-150mM,DTT,1mM,0-50mM低盐酶,100mM中盐酶,150mM高盐酶,Volume,20-100ml,TT,371-2hr（不能过长或过短）,1U核酸内切酶的酶活性：在最佳反应条件下反应1小时，完全,水解1mg标准DNA所需的酶量,27,(2)II型核酸内切酶的多酶联合酶解：,对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切，但应注意：,5GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT3,3CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA5,BamHSma,5GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT3,3CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA5,5GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT3,3CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA5,28,(2)II型核酸内切酶的多酶联合酶解：,对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法：,使用较贵酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解,低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切,一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切,0.1倍体积的3mol/LNaAcpH5.4,2.5倍体积的冰冷乙醇,冰浴5分钟、高速冷冻离心10分钟、干燥,29,6.影响限制性核酸内切酶活性的因素,(1)DNA样品的纯度：,蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等,加大酶的用量，1mgDNA用10U酶,加大反应总体积,延长反应时间,30,(2)DNA样品的甲基化程度：,识别序列中特定核苷酸的甲基化会强烈抑制限制酶的活性,因此在基因克隆中使用的是失去甲基化酶的大肠杆菌,大肠杆菌中的dam甲基化酶在5GATC3序列中的腺嘌呤N6位引入甲基，受其影响的酶有BclI、MboI等，但BamHI、BglII、Sau3AI不受影响,大肠杆菌中的dcm甲基化酶在5CCAGG3或5CCTGG3序列中的胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影响的酶有EcoRII等,哺乳动物中的甲基化酶在5CG3序列中的C5位上引入甲基,31,(3)DNA的分子结构某些限制性核酸内切酶切割超螺旋的质粒DNA或病毒DNA所需要的酶量，要比消化线性DNA的高出许多倍。此外，还有一些限制性核酸内切酶，切割不同位置的限制位点，其效率亦有明显的差别。,32,（4）核酸内切酶的缓冲液性质：,高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即所谓的Staractivity现象,例如，EcoR在正常条件下识别并切割5GAATTC3序列，但在甘油浓度超过5%（v/v）时，也可切割5AATT3序列。,33,酶活性的正常发挥，需要二价阳离子，通常是Mg2+。缓冲液TrisHCl的作用在于使反应混合物的pH恒定在酶活性所要求的最佳数值范围之内。对绝大多数限制酶来说，在pH=7.5的条件下，其功能最佳。巯基试剂对于保持某些内切酶的稳定性是有用的，但它同样也可能有利于潜在污染杂质的稳定性。,34,（5）酶切消化反应的温度大多数限制性核酸内切酶的标准反应温度都是37，但也有许多例外的情况。,35,7.限制性内切酶反应的终止消化DNA样品后，在进一步处理DNA样品前往往需要钝化内切酶的活性，钝化大多数限制性内切酶的方法是65温浴5分钟。但有些酶，如BamHI和Hae具备对热稳定性，则需加入终止反应液（加入0.5mol/L的EDTA使之在溶液中的终浓度达到10mmol/L以螯合Mg2+）。,36,限制性核酸内切酶的特点,识别位点的DNA序列具有回文结构；切割DNA均产生含5磷酸和3羟基的末端；错位切割产生粘端，沿对称轴切割产生平末端；,37,限制性核酸内切酶的应用,在特异位点上切割DNA，产生特异的限制酶切片段；用限制酶切割产生相同的粘末端以便重组；建立DNA的限制酶切图谱；构建基因组文库。,38,8.利用限制酶对DNA进行消化的具体步骤：不同的限制酶生产厂家往往推荐使用截然不同的反应条件，甚至对同一种酶也如此，所以建议遵循与酶一起提供的说明书进行操作。以下是对0.21.0ugDNA进行消化的典型反应步骤，如要对更大量的DNA进行消化，则反应的各个成分须相应放大。,39,1）加入合适体积的DNA溶液；2)加入2ul适当的10限制酶消化缓冲液，混匀；3)加入1-2单位限制酶，混匀；4)将上述混合的反应物置于适当温度并按所需的时间进行温育；5)加入0.5mol/LEDTA（pH8.0）使终浓度达10mmol/L，以终止反应；6)消化后的DNA可加入6ul凝胶电泳加样缓冲液混合后，进行电泳检测。若欲纯化酶切后的DNA，可用酚/氯仿抽提后，乙醇沉淀DNA,40,9.使用限制酶的注意点：1）限制酶十分昂贵!为能从贮存管内取出极少量的酶，只要用移液器吸头在酶溶液表面轻沾一下即可，这样可以取到少至0.1ul的酶。浓缩的限制酶也可在使用前用限制酶缓冲液稀释，但切勿用水稀释以免酶变性。2)限制酶在50甘油中保存于-20时是稳定的。进行酶切消化时，将除酶以外的所有反应成分加入后加以混匀，再从冰箱内取出贮酶管，立即放置于冰上。每次取酶时都应换一个无菌吸头，一旦限制酶中污染了DNA或其它酶，将造成财力和时间上的浪费。操作要尽可能快，用完后立即将酶放回冰箱，以使酶在冰箱外放置的时间尽可能缩短。3)尽量减少反应中的加水量以使反应体积减到最小，但要确保酶体积不超过反应总体积的1/10，否则限制酶活性将受到甘油的抑制。4)通常延长消化时间可使所需的酶量减少，这在切割大量DNA时不失为一大节约方法。在消化过程中，可取少量反应液进行电泳以判断消化程度。,41,DNA聚合酶作用的特点：（1）要有4种dNTP作为底物催化合成DNA；（2）接受模板指导；（3）需要有引物（3羟基）的存在；（4）不能起始合成新的DNA链；（5）催化dNTP加到生长中的DNA链3-OH末端；（6）催化DNA的合成方向是53。,二、DNA聚合酶(DNApolymerase),42,43,1.大肠杆菌DNA聚合酶I（DNApolI）,53的DNA聚合酶活性,53的核酸外切酶活性,35的核酸外切酶活性,（1）大肠杆菌DNA聚合酶I的基本性质：,3G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A5,5C-G-A-G-T-OH,5pppdNTPMg2+,3G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A5,5C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-OH,DNApolI,44,缺口平移（Nicktranslation）：53的核酸外切酶和聚合酶活性协同作用，使缺口向前推进,（2）大肠杆菌DNA聚合酶I的基本用途：,制备32P标记DNA探针,45,DNApolI,Mg2+5dNTP5pppdATP（-32P-dATP）,46,2.大肠杆菌DNA聚合酶I大片段（Klenow）,（1）Klenow酶的基本性质：,大肠杆菌DNA聚合酶经枯草杆菌蛋白酶处理，获得N端,三分之二的大肽段，即为Klenow酶。,Klenow酶仍拥有53的DNA聚合酶活性和35的核,核酸外切酶活性，但失去了53的核酸外切酶活性。,47,（2）Klenow酶的基本用途：,补平由核酸内切酶产生的5粘性末端,DNA片段的同位素末端标记,cDNA第二链的合成,双脱氧末端终止法测定DNA序列,48,补平由核酸内切酶产生的5粘性末端,5G-C-T-G-OHP-A-A-T-T-C-G-A-G3,3C-G-A-C-T-T-A-A-POH-G-C-T-C5,Klenow,dATPdTTP,5G-C-T-G-A-A-T-T-OHP-A-A-T-T-C-G-A-G3,3C-G-A-C-T-T-A-A-POH-T-T-A-A-G-C-T-C5,49,DNA片段的同位素末端标记,5G-C-T-G-OHP-A-A-T-T-C-G-A-G3,3C-G-A-C-T-T-A-A-POH-G-C-T-C5,Klenow,a-32P-pppdATPdTTP,5G-C-T-G-A-A-T-T-OHP-A-A-T-T-C-G-A-G3,3C-G-A-C-T-T-A-A-POH-T-T-A-A-G-C-T-C5,50,3.T4-DNA聚合酶,（1）T4-DNA聚合酶的基本特性：,在无dNTP时，可以从任何3-OH端外切,在只有一种dNTP时，外切至互补核苷酸暴露时停止,在四种dNTP均存在时，聚合活性占主导地位,53的DNA聚合酶活性和35的核酸外切酶活性,51,（2）T4-DNA聚合酶的基本用途I切平由核酸内切酶产生的3粘性末端,5G-C-T-C-T-G-C-A-OHP-G-G-A-G3,3C-G-A-G-PHO-A-C-G-T-C-C-T-C5,T4-DNA聚合酶,5G-C-T-C-OHP-G-G-A-G3,3C-G-A-G-PHO-C-C-T-C5,注意：该酶也能降解双链DNA，只是其活性比单链降解活性低很多。,52,(2)T4-DNA聚合酶的基本用途IIDNA片段的同位素末端标记,5G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T3,3C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A5,Mg2+5pppdNTPa-32P-dATP,5G-C-T-CA-G-C-T-G-OH,HO-T-C-G-A-C-C-T-C-A5,T4-DNApol,T4-DNApol,5G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T3,3C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A5,53,4.T7噬菌体DNA聚合酶,(1)T7噬菌体DNA聚合酶的基本特性：,已知DNA聚合酶中持续合成能力最强,改造后成为双脱氧终止法对长片段DNA的测序酶,53的DNA聚合酶活性和35的核酸外切酶活性,54,(2)T7噬菌体DNA聚合酶的基本用途：,用于拷贝长段模板的引物延伸反应,通过补平或交换（置换）反应进行快速末端标记,55,5.末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）,(1)TdT的基本特性：来自小牛胸腺,不需要模板的DNA聚合酶，在3端随机掺入dNTPs,5p,3HO,OH3,p5,TdT,Co2+/Mg2+dATP,5p,3HOAAAAAA,AAAAAAOH3,p5,56,TdT的基本特性：,5p,3HO,OH3,p5,TdT,Co2+/Mg2+dATP,5p,3HOAAAAAAAAAA,AAAAAAAAAAOH3,p5,5p,3HO,OH3,p5,TdT,Co2+/Mg2+dATP,5p,3HO,AAAAAAAAAAAAAAOH3,p5,AAAAAAAAAAAAA,57,（2）TdT的基本用途：,DNA片段3末端的同位素标记,给载体或目的DNA加上互补的同聚物尾,58,6.依赖于RNA的DNA聚合酶（反转录酶）,（1）反转录酶的基本特性I：以RNA为模板聚合cDNA链,3AAAAAAAAAAAAAA,5mRNA,反转录酶,Mg2+dNTP,5TTTTTTTTTTTToligo(dT)12-18,3AAAAAAAAAAAAAA,5mRNA,5TTTTTTTTTTTTTT,3cDNA,59,（1）反转录酶的基本特性II双向外切DNA-RNA杂合链中的RNA链,反转录酶,3RNA,5DNA,3,5,3RNA,5DNA,3,5,反转录酶,5DNA,3,60,（2）基因工程中常用的反转录酶：,AMV：一种提取自纯化的禽成髓细胞瘤病毒的反转录酶,禽源反转录酶在42发挥作用，而鼠源反转录酶在37发挥作用,MMLV：一种是Moloney鼠白血病病毒（MMLV）克隆的反转录酶基因在大肠杆菌的表达产物,61,（3）反转录酶的基本用途,将真核基因的mRNA转录成cDNA，构建cDNA文库；,代替Klenow片段，用于DNA序列测定。,62,7.耐热DNA聚合酶（Taq酶）,Taq酶的特点：,热稳定性；,具有5-3外切酶活性，但不具有3-5外切酶活性，因而在合成中对某些单核苷酸错配没有校正功能。,离子依赖性；,63,1.DNA连接酶的发现1967年，世界上有数个实验室几乎同时发现了一种能够催化在2条DNA链之间形成磷酸二酯键的酶，即DNA连接酶（1igase）。这种酶需要在一条DNA链的3末端具有一个游离的羟基(-OH)，和另一条DNA链的5末端具有一个磷酸基团(-P)，只有在这种情况下，才能发挥其连接DNA分子的作用。,三、DNA连接酶（DNAligase）,64,值得注意的一点是，DNA连接酶并不能连接两条单链DNA分子或环化单链DNA分子，被连接的DNA链必须是双螺旋的一部分。,65,常用的两种DNA连接酶：由大肠杆菌染色体编码的DNA连接酶由大肠杆菌T4噬菌体DNA编码的T4DNA连接酶。这两种DNA连接酶，除了前者用NAD+烟酰胺腺嘌呤二核苷酸作能源辅助因子，后者用ATP腺苷三磷酸作能源辅助因子外，其它的作用机理并没有什么差别。,66,67,68,2.DNA连接酶的基本性质,（1）修复双链DNA上缺口处的磷酸二酯键：催化5-磷酸基团和3-羟基末端之间形成磷酸二酯键。,DNA连接酶,5G-C-T-C-T-G-C-AG-G-A-G3,3C-G-A-GA-C-G-T-C-C-T-C5,OH,P,OH,P,5G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G3,3C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C5,nick,nick,69,（2）修复与RNA链结合的DNA链上缺口处的磷酸二酯键,T4-DNA连接酶,5G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G3,3C-G-A-GA-C-G-G-C-C-T-C5,OH,P,nick,5G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G3,3C-G-A-G-A-C-G-G-C-C-T-C5,70,（3）连接多个平头双链DNA分子,5G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G3,3C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C5,T4-DNA连接酶,71,3.DNA连接酶的反应条件,Tris-HCl,50-100mMpH7.5,MgCl2,10mM,ATP,0.5-1mM,DTT,5mM,Volume,10-20ml,TT,4-164-16hr,1UDNA连接酶的酶活性：在最佳反应条件下16反应1小时，,完全连接1mgl-DNA所需的酶量。,72,4.粘性末端的连接DNA连接酶最突出的特点是，它能够催化外源DNA和载体分子之间发生连接作用，形成重组DNA分子。当然，按上述这种方法构建重组体DNA分子最主要的缺点是，由限制酶切产生的具有粘性末端的载体DNA分子，在连接反应中会发生自我环化作用。为了克服这一缺点，现在的载体一般能提供多克隆位点，可采用双酶切以避免自我环化。,73,5.平头双链DNA片段的连接操作,从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的粘性末端的连接属于分子内部的连接，而平头末端的连接则属于分子间的连接，因此后者反应速度要慢得多。提高平头末端连接效率的方法包括：,加大连接酶用量（10倍大于粘性末端的连接）,加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会,加入10%PEG8000，促进大分子之间的有效作用,加入单价阳离子（NaCl），最终浓度150-200mmol/L,74,平末端DNA片段的连接方法（1）直接用T4DNA连接酶连接；（2）先用末端核苷酸转移酶，给平末端DNA分子加上同聚物尾巴之后再用DNA连接酶进行连接；（3）用衔接物连接平末端DNA分子；（4）DNA接头连接法,75,（1）直接用T4DNA连接酶连接T4DNA连接酶除了能够封闭具有3-OH和5-P末端的双链DNA的单链缺口外，在ATP和高浓度酶的条件下，它还能连接具有完全碱基配对的平末端DNA分子，但平末端连接效率不高，基因操作常不采用此法。,76,（2）同聚物加尾连接平末端DNA片段运用末端转移酶，能够将核苷酸加到DNA分子单链延伸末端的3-OH基团上，不需要模板链的存在，一个个加上核苷酸，构成由核苷酸组成的尾巴，长度可达100个核苷酸。连接分子的裂口可以通过大肠杆菌DNA聚合酶I的作用来填补；留下的单链缺口则可由DNA连接酶封闭。上述这种连接DNA分子的方法叫作同聚物尾巴连接法，简称同聚物加尾法。,77,78,(3)用衔接物连接平末端DNA分子所谓衔接物(linker)，是指用化学方法合成的一段由10-12个核苷酸组成的、具有一个或数个限制酶识别位点的寡核苷酸片段。衔接物的5末端和待克隆的DNA片段5末端，用T4多核苷酸激酶处理使之磷酸化，然后再通过T4DNA连接酶的作用使两者连接起来；接着用适当的限制酶消化具有衔接物的DNA分子和克隆载体分子，这样的结果使二者都产生出了彼此互补的粘性末端。,79,80,（4）DNA接头连接法DNA接头(adapter)连接法，于1978年由康奈尔大学吴瑞教授发明。它是一类由人工合成的一头具有某种限制性内切酶粘末端，另一头为平末端的特殊双链寡核苷酸片段。当它的平末端与平末端的外源DNA片段连接之后，会使后者成为具粘末端的新DNA分子，从而易于连接重组。,81,82,四、核酸修饰酶,1.T4-多聚核苷酸激酶（T4-PNP）,T4-PNP的基本特性：催化ATP的g-磷酸基团转移至DNA或RNA的5-OH末端上,5HO,3HO,OH3,OH5,T4-PNP,Mg2+pppATP（g-32P-ATP）,5p,3HO,OH3,p5,T4-PNP的基本用途：用于探针的末端同位素标记,83,2.碱性磷酸单酯酶：去除DNA和RNA的5端磷酸基,小牛胸腺碱性磷酸单酯酶（CIP）：68时失活,大肠杆菌碱性磷酸单酯酶（BAP）：68稳定，且耐酚抽提,5p,OH3,DNAorRNA,5pppdN,5pppN,BAP/CIP,OH3,5HO,5HOdN,5HON,作用：催化核酸分子脱掉5磷酸基团，从而使DNA或RNA片段的5-P末端转换成5-OH末端，在分子克隆中的作用是为了防止粘性末端之间的自连。,84,碱性磷酸单酯酶基本用途：,（1）去除载体DNA5端磷酸，防止载体自身环化，提高重组率。,（2）去除DNA和RNA的5端磷酸基，然后用T4多聚核苷酸激酶作用下进行末端标记。,85,3.单链核酸外切酶：核酸外切酶VII（ExoVII）,大肠杆菌的核酸外切酶VII不需要Mg2+,ExoVII,3,5,3,5,3,5,3,5,86,4.双链核