生物化学全套424P

.,蛋白质存在于所有的生物细胞中，是构成生物体最基本的结构物质和功能物质。蛋白质是生命活动的物质基础，它参与了几乎所有的生命活动过程。,第一章蛋白质(Protein),.,第一节概述,一、蛋白质的定义蛋白质：是一切生物体中普遍存在的，由天然氨基酸通过肽键连接而成的生物大分子；其种类繁多，各具有一定的相对分子质量，复杂的分子结构和特定的生物功能；是表达生物遗传性状的一类主要物质。二、蛋白质在生命中的重要性早在1878年，思格斯就在反杜林论中指出：“生命是蛋白体的存在方式，这种存在方式本质上就在于这些蛋白体的化学组成部分的不断的自我更新。”可以看出，第一，蛋白体是生命的物质基础；第二，生命是物质运动的特殊形式，是蛋白体的存在方式；第三，这种存在方式的本质就是蛋白体与其外部自然界不断的新陈代谢。现代生物化学的实践完全证实并发展了恩格斯的论断,.,1.蛋白质是生物体内必不可少的重要成分,蛋白质占干重人体中（中年人）人体45%水55%细菌50%80%蛋白质19%真菌14%52%脂肪19%酵母菌14%50%糖类1%白地菌50%无机盐7%,2.蛋白质是一种生物功能的主要体现者,（1）酶的催化作用（2）调节作用(多肽类激素)（3）运输功能（4）运动功能（5）免疫保护作用(干扰素)（6）接受、传递信息的受体（7）毒蛋白,.,3.外源蛋白质有营养功能，可作为生产加工的对象.,三、蛋白质的组成,1.元素组成蛋白质是一类含氮有机化合物，除含有碳、氢、氧外，还有氮和少量的硫。某些蛋白质还含有其他一些元素，主要是磷、铁、碘、碘、锌和铜等。这些元素在蛋白质中的组成百分比约为：碳50氢7氧23氮16%硫03其他微量,.,氮占生物组织中所有含氮物质的绝大部分。因此，可以将生物组织的含氮量近似地看作蛋白质的含氮量。由于大多数蛋白质的含氮量接近于16%，所以，可以根据生物样品中的含氮量来计算蛋白质的大概含量,蛋白质含量的测定：凯氏定氮法(测定氮的经典方法)优点：对原料无选择性，仪器简单，方法也简单；缺点：易将无机氮(如核酸中的氮)都归入蛋白质中,不精确。一般，样品含氮量平均在16%，取其倒数100/16=6.25，即为蛋白质换算系数，其含义是样品中每存在1g元素氮，就说明含有6.25g蛋白质）；故：蛋白质含量=氮的量100/166.25,.,除了上法外，还有紫外比色法双缩脲法Folin酚考马斯亮兰G250比色法（条件：蛋白质必须是可溶的）,2.化学组成（两种类型）单纯蛋白质：水解为-氨基酸结合蛋白质=单纯蛋白质+辅基,.,第二节氨基酸化学,一、氨基酸的结构与分类,(2).除甘氨酸外,其它所有氨基酸分子中的-碳原子都为不对称碳原子,所以：A.氨基酸都具有旋光性。B.每一种氨基酸都具有D-型和L-型两种立体异构体。目前已知的天然蛋白质中氨基酸都为L-型。,1.氨基酸的结构氨基酸是蛋白质水解的最终产物，是组成蛋白质的基本单位。从蛋白质水解物中分离出来的氨基酸有二十种，除脯氨酸和羟脯氨酸外，这些天然氨基酸在结构上的共同特点为：,(1).与羧基相邻的-碳原子上都有一个氨基，因而称为-氨基酸,COOHH2NCH-碳原子基团RR基团,-氨基酸基本结构通式,.,2.常见氨基酸的分类,中性AA（1）按R基团的酸碱性分酸性AA碱性AA（2）按R基团的疏水性R基团AA电性质分不带电荷极性R基团的AA带电荷R基团的AA,脂肪族A（3）按R基团的化学结构分芳香族AA杂环族AA,.,3.构成蛋白质的20种氨基酸,.,4.人体所需的八种必需氨基酸赖氨酸(Lys)缬氨酸(Val)蛋氨酸(Met)色氨酸(Try)亮氨酸(Leu)异亮氨酸(Ile)酪氨酸(Thr)苯丙氨酸(Phe)婴儿时期所需:精氨酸(Arg)、组氨酸(His)早产儿所需：色氨酸(Try)、半胱氨酸(Cys),.几种重要的不常见氨基酸在少数蛋白质中分离出一些不常见的氨基酸，通常称为不常见蛋白质氨基酸。这些氨基酸都是由相应的基本氨基酸衍生而来的。其中重要的有4-羟基脯氨酸、5-羟基赖氨酸、N-甲基赖氨酸、和3,5-二碘酪氨酸等。这些不常见蛋白质氨基酸的结构如下,.,.,二.氨基酸的重要理化性质1.一般物理性质常见氨基酸均为无色结晶,其形状因构型而异,溶解性：各种氨基酸在水中的溶解度差别很大，并能溶解于稀酸或稀碱中，但不能溶解于有机溶剂。通常酒精能把氨基酸从其溶液中沉淀析出。(2)熔点：氨基酸的熔点极高，一般在200以上。(3)味感：其味随不同氨基酸有所不同，有的无味、有的为甜、有的味苦，谷氨酸的单钠盐有鲜味，是味精的主要成分。旋光性：除甘氨酸外，氨基酸都具有旋光性，能使偏振光平面向左或向右旋转，左旋者通常用（-）表示，右旋者用（+）表示。(5)光吸收：构成蛋白质的20种氨基酸在可见光区都没有光吸收，但在远紫外区(97%以上）；B.知道蛋白质的分子量；C.知道蛋白质由几个亚基组成；D.测定蛋白质的氨基酸组成；并根据分子量计算每种氨基酸的个数。E.测定水解液中的氨量，计算酰胺的含量。,(2)测定步骤多肽链的拆分：由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分。几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质，如，血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体；可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽链(亚基).,.,测定蛋白质分子中多肽链的数目：通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。二硫键的断裂：几条多肽链通过二硫键交联在一起。可在可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过量的-巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂保护生成的巯基，以防止它重新被氧化。可以通过加入盐酸胍方法解离多肽链之间的非共价力；应用过甲酸氧化法或巯基还原法拆分多肽链间的二硫键。,.,巯基的保护,测定每条多肽链的氨基酸组成，并计算出氨基酸成分的分子比；分析多肽链的N-末端和C-末端末端氨基酸的测定：多肽链端基氨基酸分为两类，N-端氨基酸和C-端氨基酸。在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。末端氨基酸测定的主要方法有：,.,二硝基氟苯（DNFB）法丹磺酰氯法:在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以与N-端氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰-氨基酸。此法的优点是丹磺酰-氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度可以达到110-9mol。,.,肼解法：此法是多肽链C-端氨基酸分析法。多肽与肼在无水条件下加热，C-端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-端氨基酸分离。,.,氨肽酶法：氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的N-端逐个的向里水解。根基不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，按反应时间和氨基酸残基释放量作动力学曲线，从而知道蛋白质的N-末端残基顺序。最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸残基为N-末端的肽键速度最大。羧肽酶法：羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的C-端逐个的水解。根基不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，从而知道蛋白质的C-末端残基顺序。目前常用的羧肽酶有四种：A,B,C和Y；A和B来自胰脏；C来自柑桔叶；Y来自面包酵母。羧肽酶A能水解除Pro,Arg和Lys以外的所有C-末端氨基酸残基；B只能水解Arg和Lys为C-末端残基的肽键。,多肽链断裂成多个肽段，可采用两种或多种不同的断裂方法将多肽样品断裂成两套或多套肽段或肽碎片，并将其分离开来。多肽的选择性降解的方法有：,.,酶解法:胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜热菌蛋白酶，羧肽酶和氨肽酶化学法：溴化氰水解法，它能选择性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽键。,.,测定每个肽段的氨基酸顺序。确定肽段在多肽链中的次序：利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序。确定原多肽链重二硫键的位置：一般采用胃蛋白酶处理没有断开二硫键的多肽链，再利用双向电泳技术分离出各个肽段，用过甲酸处理后，将每个肽段进行组成及顺序分析，然后同其它方法分析的肽段进行比较，确定二硫键的位置。,三.蛋白质的空间结构1.蛋白质的二级结构蛋白质的二级(Secondary)结构是指肽链的主链在空间的排列,或规则的几何走向、旋转及折叠。它只涉及肽链主链的构象及链内或链间形成的氢键。主要有-螺旋、-折叠、-转角。(1).-螺旋,.,在-螺旋中肽平面的键长和键角一定,肽键的原子排列呈反式构型,相邻的肽平面构成两面角.多肽链中的各个肽平面围绕同一轴旋转，形成螺旋结构，螺旋一周，沿轴上升的距离即螺距为0.54nm,含3.6个氨基酸残基；两个氨基酸之间的距离0.15nm.肽链内形成氢键，氢键的取向几乎与轴平行，第一个氨基酸残基的酰胺基团的-CO基与第四个氨基酸残基酰胺基团的-NH基形成氢键。蛋白质分子为右手-螺旋。,左手和右手螺旋,.,（2）-折叠-折叠是由两条或多条几乎完全伸展的肽链平行排列，通过链间的氢键交联而形成的。肽链的主链呈锯齿桩折叠构象。在-折叠中，-碳原子总是处于折叠的角上，氨基酸的R基团处于折叠的棱角上并与棱角垂直，两个氨基酸之间的轴心距为0.35nm.-折叠结构的氢键主要是由两条肽链之间形成的；也可以在同一肽链的不同部分之间形成。几乎所有肽键都参与链内氢键的交联，氢键与链的长轴接近垂直。-折叠有两种类型。一种为平行式，即所有肽链的N-端都在同一边。另一种为反平行式，即相邻两条肽链的方向相反。,.,（3）-转角在-转角部分，由四个氨基酸残基组成.四个形成转角的残基中，第三个一般均为甘氨酸残基弯曲处的第一个氨基酸残基的-C=O和第四个残基的N-H之间形成氢键，形成一个不很稳定的环状结构。这类结构主要存在于球状蛋白分子中。,（）自由回转没有一定规律的松散肽链结构，但仍是紧密有序的稳定结构，通过主链间及主链与侧链间氢键维持其构象不同的蛋白质，自由回转的数量和形式各不相同分两类：紧密环连接条带,.,超二级结构和结构域（）超二级结构在蛋白质分子中，由若干相邻的二级结构单元组合在一起，彼此相互作用，形成有规则的、在空间上能辨认的二级结构组合体。几种类型的超二级结构：；超二级结构在结构层次上高于二级结构，但没有聚集成具有功能的结构域,.,（）结构域对于较大的蛋白质分子或亚基，多肽链往往由两个或两个以上相对独立的三维实体缔合而成三级结构。这种相对独立的三维实体就称结构域。结构域通常是几个超二级结构的组合，对于较小的蛋白质分子，结构域与三级结构等同，即这些蛋白为单结构域。结构域一般由100200个氨基酸残基组成，但大小范围可达40400个残基。氨基酸可以是连续的，也可以是不连续的结构域之间常形成裂隙，比较松散，往往是蛋白质优先被水解的部位。酶的活性中心往往位于两个结构域的界面上结构域之间由“铰链区”相连，使分子构象有一定的柔性，通过结构域之间的相对运动，使蛋白质分子实现一定的生物功能。在蛋白质分子内，结构域可作为结构单位进行相对独立的运动，水解出来后仍能维持稳定的结构，甚至保留某些生物活性,.,结构域与功能域的关系：有时一个结构域就是蛋白质的功能域，但不总是包含一个但通常是多个结构域蛋白质的三级结构蛋白质的三级结构是指多肽链在二级结构的基础上进一步盘旋、折叠，从而生成特定的空间结构。包括主链和侧链的所有原子的空间排布一般非极性侧链埋在分子内部，形成疏水核，极性侧链在分子表面,.,蛋白质的四级结构许多蛋白质是由两个或两个以上独立的三级结构通过非共价键结合成的多聚体，称为寡聚蛋白。寡聚蛋白中的每个独立三级结构单元称为亚基。蛋白质的四级结构是指亚基的种类、数量以及各个亚基在寡聚蛋白质中的空间排布和亚基间的相互作用。如，血红蛋白的四级结构得测定由佩鲁茨1958年完成，其结构要点为：球状蛋白，寡聚蛋白，含四个亚基两条链，两条链，22链：141个残基；链：146个残基分子量65000含四个血红素辅基亲水性侧链基团在分子表面，疏水性基团在分子内部,.,三蛋白质分子中的共价键与次级键一级结构二级结构超二级结构结构域三级结构亚基四级结构,.,维系蛋白质分子的一级结构：肽键、二硫键维系蛋白质分子的二级结构：氢键维系蛋白质分子的三级结构：疏水相互作用力、氢键、范德华力、盐键维系蛋白质分子的四级结构：范德华力、盐键,a盐键（离子键）b氢键c疏水相互作用力d范德华力e二硫键f酯键,.,氢键、范德华力、疏水相互作用力、盐键，均为次级键氢键、范德华力虽然键能小，但数量大疏水相互作用力对维持三级结构特别重要盐键数量小二硫键对稳定蛋白质构象很重要，二硫键越多，蛋白质分子构象越稳定,离子键,氢键,范德华力,疏水相互作用力,.,第四节蛋白质分子结构与功能的关系,一.蛋白质一级结构与功能的关系研究蛋白质一级结构与功能的关系主要是：研究多肽链中不同部位的残基与生物功能的关系。进行这方面的研究常用的方法有：同源蛋白质氨基酸顺序相似性分析、氨基酸残基的化学修饰及切割实验等。例1镰刀形贫血病患者血红细胞合成了一种不正常的血红蛋白（Hb-S）它与正常的血红蛋白（Hb-A）的差别：仅仅在于链的N-末端第6位残基发生了变化（Hb-A）第6位残基是极性谷氨酸残基，（Hb-S）中换成了非极性的缬氨酸残基使血红蛋白细胞收缩成镰刀形，输氧能力下降，易发生溶血这说明了蛋白质分子结构与功能关系的高度统一性,.,例2一级结构的局部断裂与蛋白质的激活体内的某些蛋白质分子初合成时，常带有抑制肽，呈无活性状态，称为蛋白质原.蛋白质原的部分肽链以特定的方式断裂后，才变为活性分子.例：胰岛素，在刚合成时，是一个比成熟的胰岛素分子大一倍多的单链多肽，称为前胰岛素原前胰岛素原的N-末端有一段肽链，称为信号肽.信号肽被切去，剩下的是胰岛素原。胰岛素原比胰岛素分子多一段C肽，只有当C肽被切除后才成为有51个残基，分A、B两条链的胰岛素分子单体.,.,例3同源蛋白同源蛋白：是指在不同有机体中实现同一功能的蛋白质.同源蛋白中的一级结构中有许多位置的氨基酸对所有种属来说都是相同的，称为不变残基；其他位置的氨基酸称可变残基.不同种属的可变残基有很大变化.可用于判断生物体间亲缘关系的远近.例：细胞色素C60个物种中，有27个位置上的氨基酸残基完全不变，是维持其构象中发挥特有功能所必要的部位，属于不变残基.可变残基可能随着进化而变异，而且不同种属的细胞色素C氨基酸差异数与种属之间的亲缘关系相关。亲缘关系相近者，氨基酸差异少，反之则多（进化树）.,.,黄色：不变残基（invariableresidues）蓝色：保守氨基酸（conservativeresidues）未标记：可变残基（variableresidues）,二.蛋白质的构象与功能的关系别构效应：又称变构效应，是指寡聚蛋白与配基结合，改变蛋白质构象，导致蛋白质生物活性改变的现象.它是细胞内最简单的调节方式.例：血红蛋白的别构效应一个亚基与氧结合后，引起该亚基构象改变进而引起另三个亚基的构象改变整个分子构象改变与氧的结合能力增加,.,第五节蛋白质的性质,一.蛋白质的分子大小蛋白质是分子量很大的生物分子，相对分子质量大于10000.最高可达40000000（烟草花叶病毒）蛋白质相对分子质量的测定方法1.根据化学成分测定最小相对分子质量此法首先利用化学分析方法测定蛋白质分子中某一特殊成分的百分含量然后，假定蛋白质分子中该成分只有一个，据其百分含量可计算出最低相对分子质量：最小相对分子质量（已知成分的相对分子、原子质量）/已知成分的百分含量如果蛋白质分子中所含已知成分不是一个单位，则真实相对分子质量等于最小相对分子质量的倍数。2.超离心法在6000080000r/min的高速离心力作用下，蛋白质分子会沿旋转中心向外周方向移动用光学方法测定界面移动的速度即为蛋白质的离心沉降速度蛋白质的沉降速度与分子大小和形状有关,.,沉降系数是溶质颗粒在单位离心场中的沉降速度，用S表示。一个S单位，为110-13秒相对分子质量越大，S值越大蛋白质的沉降系数：1200S由沉降系数S可根据斯维得贝格Svedberg方程计算蛋白质分子的相对分子质量：M=RST/D1iR：气体常数T：绝对温度D：扩散系数：溶剂的密度3.凝胶过滤法凝胶过滤所用介质为凝胶珠，其内部为多孔网状结构一定型号的凝胶网孔大小一定，只允许相应大小的分子进入凝胶颗粒内部，大分子则被排阻在外洗脱时大分子随洗脱液从颗粒间隙流下来，洗脱液体积小；小分子在颗粒网状结构中穿来穿去，历程长，后洗脱下来，洗脱体积大测定蛋白质分子量一般用葡聚糖，商品名：Sephadex,.,测得几种标准蛋白质的洗脱体积Ve以相对分子质量对数（logM）对Ve作图，得标准曲线再测出未知样品洗脱体积Ve从标准曲线上可查出样品蛋白质的相对分子质量4.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法SDS:十二烷基硫酸钠，变性剂普通蛋白质电泳的泳动速率取决于荷质比（净电荷、大小、形状）用SDS和巯基乙醇（打开二硫键）处理蛋白质变性（肽链伸展）并与SDS结合，形成SDS-蛋白质复合物不同蛋白质分子的均带负电（SDS带负电）；且荷质比相同（蛋白质分子大，结合SDS多；分子小，结合SDS少）不同蛋白质分子具有相似的构象用几种标准蛋白质相对分子质量的对数值对它们的迁移率作图测出待测样品的迁移率从标准曲线上查出样品的相对分子质量,.,影响迁移率的主要因素凝胶的分子筛效应对长短不同的棒形分子会产生不同的阻力主要因素凝胶的浓度和交联度同一电泳条件下，分子小，受阻小，游动快，迁移率大。相对分子质量大者，迁移率小优点：快速，样品用量少，可同时测几个样品缺点：误差大，约为10（误差主要来源于迁移距离的测量误差）此方法只能测得亚基肽链的相对分子质量二.蛋白质的两性离解和电泳现象蛋白质与多肽一样，能够发生两性离解，也有等电点。在等电点时(IsoelectricpointpI)，蛋白质的溶解度最小，在电场中不移动。在不同的pH环境下，蛋白质的电学性质不同。在等电点偏酸性溶液中，蛋白质粒子带负电荷，在电场中向正极移动；在等电点偏碱性溶液中，蛋白质粒子带正电荷，在电场中向负极移动。这种现象称为蛋白质电泳(Electrophoresis)。,.,蛋白质在等电点pH条件下，不发生电泳现象。利用蛋白质的电泳现象，可以将蛋白质进行分离纯化。,三.蛋白质的胶体性质由于蛋白质的分子量很大，它在水中能够形成胶体溶液。蛋白质溶液具有胶体溶液的典型性质，如丁达尔现象、布郎运动等。由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜，因此可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。四.蛋白质的沉淀作用蛋白质胶体溶液的稳定性与它的分子量大小、所带的电荷和水化作用有关。改变溶液的条件，将影响蛋白质的溶解性质在适当的条件下，蛋白质能够从溶液中沉淀出来。,.,1.可逆沉淀(1)在温和条件下，通过改变溶液的pH或电荷状况，使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。(2)在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变化，在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液，所以这种沉淀又称为非变性沉淀。(3)可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法，如等电点沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等。2.不可逆沉淀(1)在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水。(2)由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变化，所以又称为变性沉淀。(3)如加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐沉淀和生物碱沉淀等都属于不可逆沉淀。五.蛋白质的变性蛋白质的性质与它们的结构密切相关。某些物理或化学因素，能够破坏蛋白质的结构状态，引起蛋白质理化性质改变并导致其生理活性丧失。这种现象称为蛋白质的变性.,.,变性蛋白质通常都是固体状态物质，不溶于水和其它溶剂，也不可能恢复原有蛋白质所具有的性质。所以，蛋白质的变性通常都伴随着不可逆沉淀。引起变性的主要因素是热、紫外光、激烈的搅拌以及强酸和强碱等。,.,六.蛋白质的紫外吸收大部分蛋白质均含有带芳香环的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。这三种氨基酸的在280nm附近有最大吸收。因此，大多数蛋白质在280nm附近显示强的吸收。利用这个性质，可以对蛋白质进行定性鉴定。七.蛋白质的颜色反应1.双缩脲反应：两分子双缩脲与碱性硫酸铜作用，生成粉红色的复合物含有两个或两个以上肽键的化合物，能发生同样的反应肽键的反应，肽键越多颜色越深受蛋白质特异性影响小蛋白质定量测定；测定蛋白质水解程度,.,2.米伦氏反应酪氨酸的显色反应（酚羟基反应）米伦试剂为硝酸、亚硝酸、硝酸汞、亚硝酸汞的混合物蛋白溶液中，加入米伦试剂，产生白色沉淀，加热后变成红色3.乙醛酸反应在蛋白质溶液中加入HCOCOOH，将浓硫酸沿管壁缓慢加入，不使相混，在液面交界处，即有紫色环形成色氨酸的反应（吲哚环的反应）鉴定蛋白质中是否含有色氨酸明胶中不含色氨酸4.坂口反应精氨酸的反应（胍基的反应）精氨酸与-萘酚在碱性次氯酸钠（或次溴酸钠）溶液中发生反应，产生红色产物鉴定蛋白质中是否含有精氨酸定量测定精氨酸,.,5.福林试剂反应酪氨酸、色氨酸的反应（还原反应）福林试剂：磷钼酸-磷钨酸与双缩脲法结合-Lowry法在碱性条件下，蛋白质与硫酸铜发生反应蛋白质-铜络合物，将福林试剂还原，产生磷钼蓝和磷钨蓝混合物灵敏度提高100倍6.茚三酮反应灵敏度差7.黄蛋白反应浓硝酸与酪氨酸、色氨酸的反应生成黄色化合物指甲、皮肤、毛发8.考马斯亮蓝G-250本身为红色，与蛋白质反应呈蓝色与蛋白的亲和力强，灵敏度高1-1000微克/毫升,.,第六节蛋白质的分类,一.依据蛋白质的外形分类按照蛋白质的外形可分为球状蛋白质和纤维状蛋白质。1.球状蛋白质：（globularprotein）外形接近球形或椭圆形，溶解性较好，能形成结晶，大多数蛋白质属于这一类。2.纤维状蛋白质(fibrousprotein)分子类似纤维或细棒。它又可分为可溶性纤维状蛋白质和不溶性纤维状蛋白质。二.依据蛋白质的组成分类按照蛋白质的组成，可以分为1.简单蛋白(simpleprotein)：又称为单纯蛋白质；这类蛋白质只含由-氨基酸组成的肽链，不含其它成分。（1）清蛋白和球蛋白：albuminandglobulin广泛存在于动物组织中。清蛋白易溶于水，球蛋白微溶于水，易溶于稀酸中。（2）谷蛋白(glutelin)和醇溶谷蛋白(prolamin)：植物蛋白，不溶于水，易溶于稀酸、稀碱中，后者可溶于7080乙醇中。（3）精蛋白和组蛋白：碱性蛋白质，存在与细胞核中。（4）硬蛋白：存在于各种软骨、腱、毛、发、丝等组织中，分为角蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白和丝蛋白。,.,2.结合蛋白(conjugatedprotein)：由简单蛋白与其它非蛋白成分结合而成（1）色蛋白：由简单蛋白与色素物质结合而成。如血红蛋白、叶绿蛋白和细胞色素等。（2）糖蛋白：由简单蛋白与糖类物质组成。如细胞膜中的糖蛋白等。（3）脂蛋白：由简单蛋白与脂类结合而成。如血清-，-脂蛋白等。（4）核蛋白：由简单蛋白与核酸结合而成。如细胞核中的核糖核蛋白等。（5）色蛋白：由简单蛋白与色素结合而成。如血红素、过氧化氢酶、细胞色素c等。（6）磷蛋白：由简单蛋白质和磷酸组成。如胃蛋白酶、酪蛋白、角蛋白、弹性蛋白、丝心蛋白等。,.,本章小节,蛋白质的生物学作用：功能蛋白、结构蛋白蛋白质的组成（元素组成、化学组成）及蛋白质含量的测定二十种氨基酸的结构、分类及名称（三字缩写符、单字缩写符）氨基酸的重要理化性质：两性解离、茚三酮显色、与2,4-二硝基氟苯（DNFB）反应、与异硫氰酸苯酯（PITC）的反应蛋白质的一级结构：肽、肽键、活性多肽及一级结构的测定蛋白质的空间结构：二级结构单元（-螺旋、-折叠、-转角、自由回转）、三级与四级结构（超二级结构、结构域、亚基）及结构与功能的关系蛋白质的性质：大分子性质、蛋白质分子量的测定（离心法、凝胶过滤法、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法）、两性解离（等电点、电泳、离子交换）、胶体性质、蛋白质沉淀（可逆沉淀、不可逆沉淀）、蛋白质变性、紫外吸收及颜色反应蛋白质的分类：按外形及组成分类,.,第二章酶(Enzyme),.,1.酶的概念酶是一类由活性细胞产生的具有催化作用和高度专一性的特殊蛋白质。简单说，酶是一类由活性细胞产生的生物催化剂。,一、酶的概念,.,2.酶催化作用的特点(1)酶和一般催化剂的共性：加快反应速度；不改变平衡常数；自身不参与反应。(2)酶催化作用特性：条件温和：常温、常压、pH=7；高效率：反应速度与不加催化剂相比可提高1081020，与加普通催化剂相比可提高1071013；专一性：即酶只能对特定的一种或一类底物起作用，这种专一性是由酶蛋白的立体结构所决定的。可分为：绝对专一性：有些酶只作用于一种底物，催化一个反应，而不作用于任何其它物质。相对专一性：这类酶对结构相近的一类底物都有作用。包括键专一性和簇（基团）专一性。立体异构专一性：这类酶不能辨别底物不同的立体异构体，只对其中的某一种构型起作用，而不催化其他异构体。包括旋光异构专一性和几何异构专一性。易变敏感性：易受各种因素的影响，在活细胞内受到精密严格的调节控制。,.,二、酶的化学本质及结构功能特点,1.发展史(1)酶是蛋白质:1926年,JamesSummer由刀豆制出脲酶结晶确立酶是蛋白质的观念，其具有蛋白质的一切性质。(2)核酶的发现：19811982年，ThomasR.Cech实验发现有催化活性的天然RNARibozyme。L19RNA和核糖核酸酶P的RNA组分具有酶活性是两个最著名的例子。1955年，发现DNA的催化活性。(3)抗体酶（abzyme）：1986年，RichardLerrur和PeterSchaltz运用单克隆抗体技术制备了具有酶活性的抗体（catalyticantibody）。,.,酶,单成份酶：脲酶、蛋白酶、淀粉酶、核糖核酸酶等。,双成份酶,酶蛋白,辅因子,（简单蛋白质）,（结合蛋白质）,（apoenzyme）,（cofacter),辅酶（coenzyme),辅基(prostheticgroup),全酶(holoenzyme）=酶蛋白+辅因子,2.酶的组成,.,3.酶的辅因子酶的辅因子是酶的对热稳定的非蛋白小分子物质部分，其主要作用是作为电子、原子或某些基团的载体参与反应并促进整个催化过程。(1)传递电子体：如卟啉铁、铁硫簇；(2)传递氢（递氢体）：如FMN/FAD、NAD/NADP、C0Q、硫辛酸；(3)传递酰基体：如C0A、TPP、硫辛酸；(4)传递一碳基团：如四氢叶酸；(5)传递磷酸基：如ATP，GTP；(6)其它作用：转氨基，如VB6；传递CO2，如生物素。,.,维生素和辅酶维生素是机体维持正常生命活动所必不可少的一类小分子有机物质。多数维生素维生素作为辅酶和辅基的组成成分，参与体内的物质代谢。维生素一般习惯分为脂溶性和水溶性两大类。其中脂溶性维生素在体内可直接参与代谢的调节作用，而水溶性维生素是通过转变成辅酶对代谢起调节作用。某些小分子有机化合物与酶蛋白结合在一起并协同实施催化作用，这类分子被称为辅酶（或辅基）。辅酶是一类具有特殊化学结构和功能的化合物。参与的酶促反应主要为氧化-还原反应或基团转移反应。大多数辅酶的前体主要是水溶性B族维生素。许多维生素的生理功能与辅酶的作用密切相关。,.,脂溶性维生素维生素A,D,E,K均溶于脂类溶剂，不溶于水，在食物中通常与脂肪一起存在，吸收它们，需要脂肪和胆汁酸。维生素A维生素A分A1,A2两种，是不饱和一元醇类。维生素A1又称为视黄醇，A2称为脱氢视黄醇。主要功能：维持上皮组织健康及正常视觉，促进年幼动物的正常生长。,.,维生素D维生素D是固醇类化合物，主要有D2,D3,D4,D5。其中D2,D3活性最高。,.,维生素D的结构在生物体内，D2和D3本身不具有生物活性。它们在肝脏和肾脏中进行羟化后，形成1，25-二羟基维生素D。其中1，25-二羟基维生素D3是生物活性最强的。主要功能：调节钙、磷代谢，维持血液中钙、磷浓度正常，促使骨骼正常发育。,.,维生素E维生素E又叫做生育酚，目前发现的有6种，其中，四种有生理活性。主要功能：具有抗氧化剂的功能，可作为食品添加剂使用，还可保护细胞膜的完整性；同时还有抗不育的作用。,.,维生素K维生素K有3种：K1,K2,K3。其中K3是人工合成的。维生素K是2-甲基萘醌的衍生物。主要功能：促进肝脏合成凝血酶原，促进血液的凝固。,.,水溶性维生素维生素B1和羧化辅酶维生素B1又称硫胺素，在体内以焦磷酸硫胺素(TPP)形式存在。缺乏时表现出多发性神经炎、皮肤麻木、心力衰竭、四肢无力、下肢水肿。,.,焦磷酸硫胺素(TPP)是脱羧酶的辅酶，催化丙酮酸或酮戊二酸的氧化脱羧反应，所以又称为羧化辅酶。,.,维生素B2和黄素辅酶维生素B2又称核黄素，由核糖醇和6，7-二甲基异咯嗪两部分组成。缺乏时组织呼吸减弱，代谢强度降低。主要症状为口腔发炎，舌炎、角膜炎、皮炎等。,.,FAD(黄素-腺嘌呤二核苷酸)和FMN(黄素单核苷酸)是核黄素(维生素B2)的衍生物。它们在脱氢酶催化的氧化-还原反应中，起着电子和质子的传递体作用。,.,泛酸和辅酶A（CoA）维生素B3又称泛酸，是由,-二羟基-二甲基丁酸和一分子-丙氨酸缩合而成。,.,辅酶A是生物体内代谢反应中乙酰化酶的辅酶，它是含泛酸的复合核苷酸。它的重要生理功能是传递酰基，是形成代谢中间产物的重要辅酶。,.,维生素PP和辅酶I、辅酶II维生素PP包括尼克酸（又称烟酸）和尼克酰胺（又称烟酰胺）两种物质。在体内主要以尼克酰胺形式存在，尼克酸是尼克酰胺的前体。,尼克酸,尼克酰胺,.,维生素PP能维持神经组织的健康。缺乏时表现出神经营养障碍，出现皮炎。NAD+(烟酰胺-腺嘌呤二核苷酸，又称为辅酶I)和NADP+(烟酰胺-腺嘌呤磷酸二核苷酸,又称为辅酶II)是维生素烟酰胺的衍生物，它们是多种重要脱氢酶的辅酶。,.,维生素B6和磷酸吡哆醛维生素B6包括吡哆醇、吡哆醛和吡哆胺。维生素B6在体内经磷酸化作用转化为相应的磷酸脂，参加代谢的主要的是磷酸吡哆醛和磷酸吡哆胺。磷酸吡哆醛是氨基酸转氨作用、脱羧作用和消旋作用的辅酶。,.,生物素生物素是B族维生素B7，它是多种羧化酶的辅酶。生物素的功能是作为CO2的递体，在生物合成中起传递和固定CO2的作用。,.,叶酸和叶酸辅酶维生素B11又称叶酸，作为辅酶的是叶酸加氢的还原产物四氢叶酸。四氢叶酸的主要作用是作为一碳基团，如-CH3,-CH2-,-CHO等的载体，参与多种生物合成过程。,.,维生素B12和B12辅酶维生素B12又称为钴胺素。维生素B12分子中与Co+相连的CN基被5-脱氧腺苷所取代，形成维生素B12辅酶。维生素B12辅酶的主要功能是作为变位酶的辅酶，催化底物分子内基团(主要为甲基)的变位反应。,.,.,维生素C维生素C能防治坏血病，故又称抗坏血酸。在体内参与氧化还原反应，羟化反应。人体不能合成。,.,硫辛酸硫辛酸是少数不属于维生素的辅酶。硫辛酸是6,8-二硫辛酸，有两种形式：即硫辛酸（氧化型）和二氢硫辛酸（还原型）。,.,辅酶Q（CoQ）辅酶Q又称为泛醌，广泛存在与动物和细菌的线粒体中。辅酶Q的活性部分是它的醌环结构，主要功能是作为线粒体呼吸链氧化-还原酶的辅酶，在酶与底物分子之间传递电子。,.,4.酶结构与功能特点蛋白质的结构特点：一级、二级、三级、四级结构根据结构不同酶可分为：单体酶：只有单一的三级结构蛋白质构成。寡聚酶：由多个（两个以上）具有三级结构的亚基聚合而成。多酶复合体：由几个功能相关的酶嵌合而成的复合体。,.,与催化作用相关的结构特点(1)活性中心：酶分子中直接和底物结合并起催化反应的空间局限（部位）。,结合部位(Bindingsite)：酶分子中与底物结合的部位或区域一般称为结合部位。,.,.,催化部位(Catalyticsite):酶分子中促使底物发生化学变化的部位称为催化部位。通常将酶的结合部位和催化部位总称为酶的活性部位或活性中心。结合部位决定酶的专一性，催化部位决定酶所催化反应的性质。,.,.,调控部位(Regulatorysite):酶分子中存在着一些可以与其他分子发生某种程度的结合的部位，从而引起酶分子空间构象的变化，对酶起激活或抑制作用,.,(2)必须基团：酶表现催化活性不可缺少的基团。亲核性基团：丝氨酸的羟基，半胱氨酸的巯基和组氨酸的咪唑基。酸碱性基团：门冬氨酸和谷氨酸的羧基，赖氨酸的氨基，酪氨酸的酚羟基，组氨酸的咪唑基和半胱氨酸的巯基等。,亲核性基团,酸碱性基团,.,(3)酶原和酶原的激活：酶原：没有活性的酶的前体。酶原的激活：酶原在一定条件下经适当的物质作用可转变成有活性的酶。酶原转变成酶的过程称为酶原的激活。本质：酶原的激活实质上是酶活性部位形成或暴露的过程。(4)同功酶：能催化同一化学反应的一类酶。活性中心相似或相同：催化同一化学反应。分子结构不同：理化性质和免疫学性质不同。,.,三、酶的分类及命名,1.酶的分类氧化-还原酶Oxidoreductase氧化-还原酶催化氧化-还原反应。主要包括脱氢酶(Dehydrogenase)和氧化酶(Oxidase)。如，乳酸(Lactate)脱氢酶催化乳酸的脱氢反应。,.,(2)转移酶Transferase转移酶催化基团转移反应，即将一个底物分子的基团或原子转移到另一个底物的分子上。例如，谷丙转氨酶催化的氨基转移反应。,.,水解酶Hydrolase水解酶催化底物的加水分解反应。主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。例如，脂肪酶(Lipase)催化的脂的水解反应,.,(4)裂解酶Lyase裂合酶催化从底物分子中移去一个基团或原子形成双键的反应及其逆反应。主要包括醛缩酶、水化酶及脱氨酶等。例如，延胡索酸水合酶催化的反应。,.,(5)异构酶Isomerase异构酶催化各种同分异构体的相互转化，即底物分子内基团或原子的重排过程。例如，6-磷酸葡萄糖异构酶催化的反应。,.,(6)合成酶LigaseorSynthetase合成酶，又称为连接酶，能够催化C-C、C-O、C-N以及C-S键的形成反应。这类反应必须与ATP分解反应相互偶联。A+B+ATP+H-O-H=AB+ADP+Pi例如，丙酮酸羧化酶催化的反应丙酮酸+CO2草酰乙酸,.,核酸酶（催化核酸）Ribozyme核酸酶是唯一的非蛋白酶。它是一类特殊的RNA，能够催化RNA分子中的磷酸酯键的水解及其逆反应。,.,2.酶的命名,(1)习惯命名法:根据其催化底物来命名；根据所催化反应的性质来命名；结合上述两个原则来命名；有时在这些命名基础上加上酶的来源或其它特点。,.,(2)国际系统命名法系统名称包括底物名称、构型、反应性质，最后加一个酶字。例如：习惯名称:谷丙转氨酶系统名称:丙氨酸：-酮戊二酸氨基转移酶酶催化的反应:谷氨酸+丙酮酸-酮戊二酸+丙氨酸,.,1.酶催化作用的本质：降低反应活化能2.酶催化作用的中间产（络合）物学说在酶催化的反应中，第一步是酶与底物形成酶底物中间复合物。当底物分子在酶作用下发生化学变化后，中间复合物再分解成产物和酶。E+S=E-SP+E许多实验事实证明了ES复合物的存在。ES复合物形成的速率与酶和底物的性质有关。,四、酶作用的机制,.,3.酶与底物结合形成中间络合物的方式（理论）(1)锁钥假说(lockandkeyhypothesis)：认为整个酶分子的天然构象是具有刚性结构的，酶表面具有特定的形状。酶与底物的结合如同一把钥匙对一把锁一样(2)诱导契合假说（inducedfithypothesis):该学说认为酶表面并没有一种与底物互补的固定形状，而只是由于底物的诱导才形成了互补形状.,.,4.使酶具有高效催化的因素(1)临近定向效应：在酶促反应中，底物分子结合到酶的活性中心，一方面底物在酶活性中心的有效浓度大大增加，有利于提高反应速度；另一方面，由于活性中心的立体结构和相关基团的诱导和定向作用，使底物分子中参与反应的基团相互接近，并被严格定向定位，使酶促反应具有高效率和专一性特点。(2)“张力”和“形变”：底物与酶结合诱导酶的分子构象变化，变化的酶分子又使底物分子的敏感键产生“张力”甚至“形变”，从而促使酶底物中间产物进入过渡态。,.,(3)酸碱催化：酸-碱催化可分为狭义的酸-碱催化和广义的酸-碱催化。酶参与的酸-碱催化反应一般都是广义的酸碱催化方式。广义酸碱催化是指通过质子酸提供部分质子,或是通过质子碱接受部分质子的作用，达到降低反应活化能的过程。酶活性部位上的某些基团可以作为良好的质子供体或受体对底物进行酸碱催化。His残基的咪唑基是酶的酸碱催化作用中最活泼的一个催化功能团。,广义酸基团广义碱基团（质子供体）（质子受体）,.,(4)共价催化：催化剂通过与底物形成反应活性很高的共价过渡产物，使反应活化能降低，从而提高反应速度的过程，称为共价催化。酶中参与共价催化的基团主要包括His的咪唑基，Cys的硫基，Asp的羧基，Ser的羟基等。某些辅酶，如焦磷酸硫胺素和磷酸吡哆醛等也可以参与共价催化作用。,.,1.底物浓度对酶促反应速度影响在酶浓度，pH，温度等条件不变的情况下研究底物浓度和反应速度的关系。如右图所示：在低底物浓度时,反应速度与底物浓度成正比，表现为一级反应特征。当底物浓度达到一定值，几乎所有的酶都与底物结合后，反应速度达到最大值（Vmax），此时再增加底物浓度，反应速度不再增加，表现为零级反应。,五、酶促反应的速度及其影响因素,.,米氏方程1913年，德国化学家Michaelis和Menten根据中间产物学说对酶促反映的动力学进行研究，推导出了表示整个反应中底物浓度和反应速度关系的著名公式，称为米氏方程。,Km米氏常数Vmax最大反应速度,.,根据中间产物学说，酶促反应分两步进行:,米氏方程的推导：,.,.,米氏常数Km的意义:,由米氏方程可知，当反应速度等于最大反应速度一半时,即V=1/2Vmax,Km=S上式表示,米氏常数是反应速度为最大值的一半时的底物浓度。因此,米氏常数的单位为mol/L。不同的酶具有不同Km值，它是酶的一个重要的特征物理常数。Km值只是在固定的底物，一定的温度和pH条件下，一定的缓冲体系中测定的，不同条件下具有不同的Km值。Km值表示酶与底物之间的亲和程度：Km值大表示亲和程度小，酶的催化活性低;Km值小表示亲和程度大,酶的催化活性高。,.,测定Km和V的方法很多，最常用的是LineweaverBurk的作图法双倒数作图法。,1Km11=+VVmaxSVmax,取米氏方程式的倒数形式：,1/Vmax,斜率=Km/Vmax,-1/Km,米氏常数Km的测定：,.,2.抑制剂对酶反应的影响有些物质能与酶分子上某些必须基团结合（作用),使酶的活性中心的化学性质发生改变，导致酶活力下降或丧失，这种现象称为酶的抑制作用。能够引起酶的抑制作用的化合物则称为抑制剂（inhibitor)。酶的抑制剂一般具备两个方面的特点：a.在化学结构上与被抑制的底物分子或底物的过渡状态相似。b.能够与酶的活性中心以非共价或共价的方式形成比较稳定的复合体或结合物。,.,抑制作用的类型：(1)不可逆抑制作用：抑制剂与酶反应中心的活性基团以共价形式结合，引起酶的永久性失活。如有机磷毒剂二异丙基氟磷酸酯。,.,(2)可逆抑制作用：抑制剂与酶蛋白以非共价方式结合，引起酶活性暂时性丧失。抑制剂可以通过透析等方法被除去，并且能部分或全部恢复酶的活性。根椐抑制剂与酶结合的情况，又可以分为三类：竞争性抑制：某些抑制剂的化学结构与底物相似，因而能与底物竟争与酶活性中心结合。当抑制剂与活性中心结合后，底物被排斥在反应中心之外，其结果是酶促反应被抑制了。竟争性抑制通常可以通过增大底物浓度，即提高底物的竞争能力来消除。竞争性抑制可用下式表示：,.,.,.,.,有竞争性抑制剂存在时，Km值增大(1+I/Ki)倍，且Km值随I的增高而增大；在E固定时，当SKm(1+I/Ki),Km(1+I/Ki)项可忽略不计，则v=Vmax，即最大反应速度不变。,竞争性抑制作用的速度方程：,.,竞争性抑制作用的LineweaverBurk图：,.,非竞争性抑制：酶可同时与底物及抑制剂结合，引起酶分子构象变化，并导至酶活性下降。由于这类物质并不是与底物竞争与活性中心的结合，所以称为非竞争性抑制剂。如某些金属离子（Cu2+、Ag+、Hg2+）以及EDTA等，通常能与酶分子的调控部位中的-SH基团作用，改变酶的空间构象，引起非竞争性抑制。非竟争性抑制不能通过增大底物浓度的方法来消除。非竞争性抑制可用下式表示：,.,.,有非竞争性抑制剂存在时，V值减小(1+I/Ki)倍，且V值随I的增高而降低；Km值不变。,非竞争性抑制作用的速度方程：,.,非竞争性抑制作用的LineweaverBurk图：,.,有反竞争性抑制剂存在时，Km和V值均减小(1+I/Ki)倍，且都随I的增高而降低。,反竞争性抑制：酶只有在与底物结合后，才能与抑制剂结合，引起酶活性下降。反竞争性抑制可用下式表示：反竞争性抑制作用的速度方程：,.,反竞争性抑制作用的LineweaverBurk图：,.,3.激活剂对酶反应的影响凡是能提高酶活力的简单化合物都称为激活剂（activator)。其中大部分是一些无机离子和小分子简单有机物。如：Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+、Co2+、Cr2+、Fe2+、Cl-、Br-、I-、CN-、NO3-、PO4-等；这些离子可与酶分子上的氨基酸侧链基团结合，可能是酶活性部位的组成部分，也可能作为辅酶或辅基的一个组成部分起作用；一般情况下，一种激活剂对某种酶是激活剂，而对另一种酶则起抑制作用；对于同一种酶，不同激活剂浓度会产生不同的作用。4.酶浓度对酶反应的影响在底物足够过量而其它条件固定的情况下，并且反应系统中不含有抑制酶活性的物质及其他不利于酶发挥作用的因素时，酶促反应的速度和酶浓度成正比。,.,5.温度对酶反应的影响一方面是温度升高,酶促反应速度加快。另一方面,温度升高,酶的高级结构将发生变化或变性，导致酶活性降低甚至丧失。因此大多数酶都有一个最适温度。在最适温度条件下,反应速度最大。,最适温度,.,6.pH对酶反应的影响在一定的pH下,酶具有最大的催化活性,通常称此pH为最适pH。,.,.,7.酶的别构（变构）效应：由于效应物的存在，而引起酶的结构（构象）变化。别构酶(Allostericenzyme)的特点：一般是寡聚酶，由多亚基组成，包括催化部位和调节（别构）部位；具有别构效应。指酶和一个配体（底物，调节物）结合后可以影响酶和另一个配体（底物）的结合能力。,相同（均为底物）：同促效应（homotropiceffect）,不同（效应调节物）：异促效应（heterotropiceffect）,根据配体结合后对后继配体的影响,根据配体性质,正协同效应（positivecoo