高密度发酵PPT课件

. 1、第9节高密度发酵、高密度发酵：培养液中工程菌菌体浓度在50gDCW/L以上，理论上最高值可达200gDCW/L。 高密度发酵提高了发酵罐内菌体密度，提高了产物的细胞水平，相应地减少了生物反应器的体积，提高了单位体积的设备生产能力，降低了生物质的分离费用，缩短了生产周期，降低了生产成本，提高了生产效率。2、1、影响高密度发酵的因素、培养基溶解氧； pH； 温度代谢副产物1培养基：的高密度发酵对基质中营养源的种类和含量要求高，例如碳源和氮源的比例少，菌体生长旺盛，菌体早期老化自溶的比例增大，菌体繁殖数减少，细胞代谢不均衡，对产物积累不利。3、葡萄糖是高密度发酵常用的碳源，但浓度过高会产生醋酸，保证低葡萄糖浓度。 氮源、微量元素和无机盐对细菌增殖和外源蛋白表达均有很大影响。4、2溶解氧浓度随着发酵时间的延长，菌体密度迅速增加，溶解氧浓度降低，细胞生长变慢。 特别是在高密度发酵后期，由于菌体密度的增大，耗氧量极大，发酵槽各物理参数不能满足供氧需求，菌体生长极慢，外源蛋白表达量也差。 5、发酵过程中要确保适当的溶解氧浓度，必须决定发酵槽的通气量和搅拌速度。 在一定范围内，通气量越大，溶解氧浓度越高。 气流速度过大，发酵液产生大量泡沫，降低罐的有效利用率。 6，3pH大肠杆菌应利用葡萄糖产酸剂，特别是大量乙酸和二氧化碳降低pH，将ph调节在适当的范围内。7、4温度培养温度在适当范围内，对于温控诱导表达的基因工程菌来说，诱导时机和持续时间对重组蛋白质产量有很大影响。 8、5代谢副产物乙酸二氧化碳葡萄糖浓度超过某一阈值时，会产生乙酸，增长率过高，供氧不足，也会产生乙酸。 为了减少培养基中代谢副产物的积累，可以采取流补料措施，维持适当的比生长速度，向培养基中添加氨基酸。9、2、实现高密度发酵的方法，1改善发酵条件选择培养基：以甘油为碳源流动培养：营养过高抑制细胞生长，高密度发酵以低于抑制阈值的浓度开始，营养物必须保持高生长速度才能添加。 提高氧气供给能力：在增加空气和氧气混合气体流动压力的发酵液中添加过氧化氢。10、2构建乙酸氧化能力低的工程宿主菌可以通过改善发酵条件来减少乙酸的产生，但是通过切断细胞代谢网络上产生乙酸的生物合成途径来构建乙酸氧化能力低的工程宿主菌从根本上解决问题的途径之一、11、阻断醋酸产生的主要方法：基因敲除或突变引起的醋酸代谢突变株。 分流碳代谢流：丙酮酸代谢有选择地向乙醇方向进行。 12、限制进入糖解途径的碳代谢流：大肠杆菌摄取葡萄糖是在磷酸转移酶系统的作用下以基位错方式进行的，用基因敲除法限制葡萄糖的摄取速度。 血红蛋白基因的导入：提高大肠杆菌在缺氧条件下的氧气利用率。构建13，3蛋白质水解酶活力低的工程宿主菌，对于以可溶性或分泌形式表达的目标蛋白质，随着发酵后期各种蛋白质水解酶的积累，目标蛋白质在蛋白质水解酶的作用下被分解。14、第8节基因工程药物的分离纯化、基因工程药物的分离纯化非常重要。 表达的是多肽或蛋白质。 其制备具有以下特点：15，表达产物在初始材料中含量低初始材料组成复杂，多含细胞、代谢产物、残留培养基等。表达产物稳定性差，易失活变性表达产物种类多，结构不同，活性不同其质量要求纯度高，无菌，无热原。16、一、建立分离纯化技术依据，包括目标物在内的初始材料特征菌种类型和代谢特性。 原材料培养基的来源及其质量。 生产技术和条件。 物料中杂质的种类和性质。 目标物的特性。 产品质量要求。17、2、分离纯化的基本过程是基因工程药物不是来自正常细胞而是来自细胞，因此对产品纯度的要求也高于传统产品。 基因工程药物的分离纯化一般不得超过45个阶段。 包括细胞破碎、固液分离、浓缩和初步纯化、高度纯化到纯品和成品加工。 18、基因工程药物分离纯化的一般工艺、发酵液、细胞分离、胞内产物、胞外产物、细胞破碎、固液分离、内含物、细胞碎片分离、变性、复原性、浓缩、初步分离、高度纯化、制剂、制品、制品、19、分离纯化技术要求：技术条件温和，可维持生物活性。 选择性好，可从复杂混合物中有效分离目标物，达到较高的纯化倍率。20、收率高。 两种技术直接相连，无需处理材料。 精制过程快，满足高生产率的要求。21，3，细胞破碎方法，物理法：匀浆法珠磨机法和超声波法化学法：渗透冲击，可溶化法生物法：酶溶解法，22，1，物理破碎法，匀浆法：高压下使细胞悬浮液通过针阀后，通过高速冲击和急减压使细胞破裂的方法。 不适合大规模应用，容易引起堵塞的团状或丝状真菌。23、高速珠磨法：将细胞悬浮液与研磨剂一起快速搅拌或研磨，利用玻璃珠之间以及玻璃珠与细胞之间的相互剪切、碰撞促进细胞壁破裂，释放内容物。 发生了大量的热量，必须采取冷却措施。24、超声波破碎法：利用超声波处理细胞悬浮液，超声波作用下液体起到空化作用，孔洞的形成、增大和封闭产生极大的冲击波和剪切力，破碎细胞。 可处理少量样品，发热大，敏感物质易失活。25、2、化学破碎法、渗透冲击：首先将细胞置于高渗透压介质中，达到平衡后，突然稀释介质，在渗透压冲击下使细胞壁和膜膨胀破裂。 细胞壁适用于脆弱的经酶处理的细胞壁。26、增溶法：利用表面活性剂等化学试剂的增溶作用，增加细胞壁和膜的渗透性，破碎细胞的方法。 表面活性剂： SDS； TritonX-100有机溶剂：乙醇； 异丙醇、尿素缺点：添加新的化学制剂，引起新的污染。27、3、生物破碎法、酶溶解法：用生物酶消化细胞壁和细胞膜的方法。 细胞壁溶解酶是一些酶的复合体，必须根据处理细胞的结构和化学组成选择合适的酶，并决定合适的使用顺序。 价格昂贵，回收利用困难，仅供实验室使用。28、4、固液分离、1、离心沉淀2、超滤：微过滤反渗透3、双水相萃取：将两种水溶性高分子或一种高分子与无机盐在水溶液中混合. 两相都含有很多水。29，5，重组蛋白的分离纯化，目标产物中含有很多杂质，必须进行分离纯化。 蛋白质分离纯化方法的设计取决于其分子的理化性质和生物学特性。、30、产物的特性作用等电点是离子交换种类和条件对分子量不同孔径的介质疏水性和疏水、反相介质结合程度生物特异性决定亲和基溶解性决定分离体系和蛋白浓度稳定性的工艺采用温度和工艺时间，、产物的特性作用于分离纯化31， 分离纯化的方法依赖于色谱分离方法，1、离子交换色谱的基本原理是通过将带电溶质分子与离子交换剂中可交换的离子交换来达到分离的目的。 它的分辨率高，容量大，操作容易，该方法已成为多肽蛋白核酸分离纯化的重要方法。32、2、疏水色谱、疏水色谱是利用蛋白质表面疏水区域与固定相上疏水基相互作用的差异来分离蛋白质成分的色谱。 蛋白质和疏水介质的力量小，分离过程中活性不易丧失。33、3、亲和色谱、亲和色谱是利用抗体与抗原、受体与激素、酶与基质之间的作用等固定化配体与目标蛋白质之间的特异生物亲和性来吸附的。34、配基：用亲和色谱可逆结合的特异性物质。 载体：与配体结合的载体。 亲和层析法大致可分为三个阶段。 配体固定化吸附对象物样品解吸、35、4、凝胶过滤、凝胶过滤以大小一定的多孔性凝胶为分离介质，小分子可以进入孔内，在柱子中可以缓慢运动，大分子不能进入孔内，可以迅速运动，利用该移动差分离大分子和小分子. 36、主要应用两个方面：脱盐和缓冲液的交换蛋白质分子的分级分离。 在产品形成阶段之前去除产物的多聚体和分解产物。 37、基因工程药物生产常用的分离纯化方法：细胞、细胞碎片、颗粒性杂质阴离子交换色谱法对杂质蛋白、脂质、DNA、病毒进行40nm微孔滤膜过滤，再用病毒阳离子交换色谱法对牛血清蛋白和转铁蛋白等滤膜过滤沉淀物， 病毒疏水色谱法离心/过滤除去残留杂质蛋白凝胶过滤和多聚体分离0.22m微孔过滤除菌的六、除去非蛋白质杂质、DNA、纯化热原质和病毒的方法： 1、