土壤中分解尿素的细菌的分离与计数ppt

课题2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数,一、课题背景(理论基础),1、尿素的利用,尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。,2、细菌利用尿素的原因,土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶,3、课题目的,从土壤中分离出能够分解尿素的细菌,统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌,一.研究思路,.筛选菌株,.统计菌落数目,.设置对照,一、研究思路,(一)筛选菌种,1实例：寻找耐高温的DNA聚合酶,启示：,PCR技术：要求使用耐高温（930C）的DNA聚合酶。,寻找目的菌种时要根据它对_，到相应的环境中去寻找。,生存环境的要求,耐高温的酶,耐高温生物体,耐高温环境（热泉、火山口）,寻找,寻找,Taq细菌,筛选原因:因为热泉的高温条件淘汰了绝大多数微生物，使耐热的Taq细菌保留下来。,2、实验室中微生物的筛选原理（同实例）：,人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。菌株：菌株又称品系，表示任何由一个独立分离的单细胞(或单个病毒粒子)繁殖而成的纯种群体及其后代。因此,一种微生物的每一个不同来源的纯培养物均可称为该菌种的一个菌株。,3、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：,在此培养基中哪些作为碳源、氮源？,碳源：葡萄糖、尿素氮源：尿素,培养基选择分解尿素的微生物的原理：培养基中尿素为唯一氮源，只有能合成脲酶分解尿素的微生物才能生长、发育、繁殖,从物理性质看此培养基属于哪类？功能上属于哪类？,固体培养基、选择培养基,此配方能否筛选出产生脲酶的细菌？为什么？,原则上能。只有产生脲酶的细菌能利用尿素作为氮源而生存。但实际实验中有些细菌可以以其他细菌代谢产生的废物生长，因此需进一步鉴别,4选择培养基：,在微生物学中，将允许_，同时_生长的培养基。,特定种类的微生物生长,抑制或阻止其他种类微生物,结果：培养一定时间后，该菌数量上升，再通过稀释涂布平板等方法对它进行纯化培养分离。,5、怎样证明此培养基具有选择性呢？,以尿素为唯一氮源的培养基,牛肉膏蛋白胨培养基,是,分离尿素细菌,判断该培养基有无选择性,只生长尿素细菌,生长多种微生物,是,实验流程：,样品稀释涂布平板,微生物的培养与观察,菌落计数,二、实验设计,土壤取样,制备培养基,（一）土壤取样,从肥沃、酸碱度接近中性的湿润土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。注意取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。操作要在火旁（称、装、稀释等）,“微生物的天然培养基”,数量最大、种类最多,大约70%90%是细菌,（二）制备培养基,制备选择培养基（尿素为唯一氮源）制备牛肉膏蛋白胨培养基相同的菌液，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，因此，牛肉膏蛋白胨培养基可以作为对照，用来判断选择培养基是否起到了选择作用。,（对照作用）,思考？为什么还要制备牛肉膏蛋白胨培养基？,三样品稀释,注意：应在火焰旁称取土壤10g。在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行稀释倍数为101106。初次范围宽些稀释101107，稀释试管按梯度排序,并编号,.取样涂布,分离不同的微生物采用不同的稀释度,原因：不同微生物在土壤中含量不同,看课本P22，并讨论你认为这两位同学的作法正确吗？如果有问题，错在哪？,第一位同学：没有重复实验（至少涂布3个平板）第二位同学：21个结果误差过大，不应用于计算平均值，应取30300的平板进行计数,(三)设置对照实验,阅读P2223页“（三）设置对照”一段讨论教材中提出的问题。,设置对照的目的：,排除实验组中非测试因素对试验结果的影响，提高实验结果的可信度。,(1)A同学出现此结果的可能原因？,土样不同培养基污染(或混入了其他的含氮物质),(2)设置对照实验，帮助A同学排除上述两个可能影响实验结果的因素？,这个实例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少,方案一：由其他同学用与A同学相同土样进行实验,方案二：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。,结果预测：如果结果与A同学一致，则证明_；如果结果不同，则证明A同学存在_,A无误,培养基的配,制有问题。,每个稀释度均用3个选择培养基和1个牛肉膏蛋白胨培养基（原因？）。初次范围宽些稀释101107，涂布平板选103107，取小于0.1ml,注意实验时要对培养皿作好标记。注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。,.微生物的培养与观察,培养不同微生物往往需要不同培养温度。细菌：3037培养12d放线菌：2528培养57d霉菌：2528的温度下培养34d。本实验放在30培养，比较牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基中菌落数量、形态并记录,（六）菌落计数,1、在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。2、选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。3、在同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数然后求平均值。4、对于不同稀释度下按下面情况计算：选择平均菌落数在30-300之间的，当只有一个稀释倍数的平均菌落数符合此范围时，则以该平均菌落乘以稀释倍数即得若有两个平均数在30-300之间，则按两者比值来决定，比值小于2，算平均数。若比值大于2取较小的菌落总数,1显微镜直接计数：,利用血球计数板(血细胞计数板），在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。,不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察；,缺点,统计菌落数目：,2.间接计数法（活菌计数法）原理：在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的，即一个菌落代表原先的一个单细胞。常用方法：稀释涂布平板法。,每克样品中的菌落数(CV)M其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表稀释倍数。,2稀释涂布平板法（间接计数）,101,102,103,104,105,106,计算公式：,某同学在稀释倍数为106的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234，那么每克样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1ml）()A.2.34108B.2.34109C.234D.23.4,B,每克样品中的菌株数=（CV）M,注意事项为了保证结果准确，一般选择菌落数在30300的平板上进行计数。为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或三个以上的平皿中，经涂布，培养计算出菌落平均数。统计的菌落往往比活菌的实际数目低。(原因？思考),菌落,菌落,一般来说，在一定培养条件下（相同的培养基、温度及培养时间）同种微生物表现出稳定的菌落特征，如大小、形状、光泽度、颜色、硬度、透明度等方面具有一度的特征，菌落特征可作为菌种鉴定的重要依据。,如果得到了2个或2个以上菌落数目在30300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确，需要重新实验。,一无菌操作1、取土用的小铁铲的盛土样的信封在使用前都需要灭菌。2、应在火焰旁称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入锥形瓶中，塞好棉塞。3、在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。二做好标记注明培养基种类、培养日期、平板培养样品的稀释度等。三制定计划,三、操作提示,四、结果分析与评价,1.培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出菌落？,对照的培养皿无菌落说明培养基没有污染。牛肉膏培养基的菌落数目多余选择培养基的菌落数目，说明选择培养基已筛选出一些菌落。,四、结果分析与评价,2.获得某一稀释度下，菌落数30300的平板，在这以稀释度下是否至少有两个平板的菌落数相接近？,相接近，说明操作成功。,3.提示：选择每个平板上长有30300个菌落的稀释倍计算每克样品的菌数最合适。同一稀释倍数的三个重复的菌落数不能相差悬殊，如相差较大，表示实验不精确。,五、课题延伸,1.在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。,2.测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到伊红-美蓝培养基上培养，大肠杆菌菌落呈现黑色，通过记算得出水样中大肠杆菌的数量。,大肠杆菌呈黑色中心,有或无金属光泽,大肠杆菌在伊红美蓝琼脂(EMB)上典型特征,本课题知识小结:,巩固练习,1.使用选择培养基的目的是（）A.培养细菌B.培养真菌C.使需要的微生物大量繁殖D.表现某微生物的特定性状与其他微生物加以区别2.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是()A.CO2和N2B.葡萄糖和NH3C.CO2和尿素D.葡萄糖和尿素,C,D,3.下列说法不正确的是（）A.科学家从7080度热泉中分离到耐高温的TaqDNA聚