细菌性食物中毒的快速检验.ppt

5/23/2020，1，细菌食物中毒的快速检查，平山县CDC，5/23/2020，2，正义，食物性传播疾病世界卫生组织通过吃食物性传播疾病“感染人体的病原体，感染人或中毒性疾病，统称食物性疾病”5/23/2020，3，定义，食物中毒包含生物性、化学性、有毒有害物质，或将有毒有害物质视为食物摄取后发生的传染性急性或亚急性非性病的食物，食物中毒是由暴食引起的急性胃肠炎、食源性肠道传染病(伤寒等)和寄生虫病(囊胞症等)或特定有毒有害物质的过量5/23/2020，4，食物中毒诊断标准主要基于流行病学调查资料和患者的潜伏期和中毒特有的见解，实验室诊断旨在确定中毒的原因。食物中毒诊断标准和技术处理一般GB14938-1994，5/23/2020，5，中毒特性，5/23/2020，6，细菌性食物中毒检查，样品采集检查程序直接涂层，染色，显微镜检查活菌数测定5/23/2020，7，酶联荧光免疫测定法，e . colio 1573360 H7的抗原鉴定基于VIDAS设备的酶联荧光免疫测定法。像吸管这样的装置是在分析中同时用作固体和吸入器的固相容器(SPR)。SPR包由高特异性单克隆抗体混合物组成。向试剂台添加一定量的增液肉汤后，汤的混合物在特定时间内循环SPR内外。如果有E.coliO157:H7抗原，则与SPR内封装的单克隆抗体结合，其他未结合的化合物将被冲洗掉。具有碱性磷酸酶的抗体与SPR内外结合在SPR内壁的E.coliO157:H7抗原结合，最终洗涤阶段冲洗未结合的混合物。基质-4-甲基伞状磷酸酮由SPR壁上的酶转化为荧光产物-4-甲基伞状酮。荧光强度由光学扫描仪确定。测试结果由计算机自动分析，将基于荧光测试的测试值与标准进行比较，然后输出每个被测试样品的阳性或阴性结果报告。5/23/2020，8，分子生物学检测技术，聚合酶链反应在体外酶扩增特定DNA或RNA片段的技术是变性Templatedenaturation退火Primerannealing扩展Primerextension的三个基本阶段作为反应的引物，四个脱氧核苷三磷酸(dNTPs)作为合成DNA的原料，有DNA聚合酶(polymerase)，催化剂DNA的合成具有适当的盐、缓冲液和温度循环参数，提供了酶反应的最佳条件，保证了反应。5/23/2020，10，5/23/2020，12，5/23/2020，13，5/23/2020，14在第一个循环中，使用两个互补的DNA作为模板，从引物3段开始扩展，其5段是固定的，3 段随着延长时间的增加而增大，因此该循环的产品长度是不确定的。5/23/2020，17，2，PCR技术的特征，高特异性：PCR反应的特定决定因素包括：以碱基对原理正确结合引物和模板DNA特异性；DNA聚合酶合成反应的保真度；目标基因的特异性和保守性，5/23/2020，18，高灵敏度：PCR产物量呈指数增长，可以将峰值(pg=10-12)水平的初始测试模板放大到微克(ug=10-6)水平。可以从100万个细胞中检测到目标细胞。在细菌检测中，最小检出率为3种细菌。在病毒检测中，PCR的敏感度最多可以达到三个空斑形成单元(PFU)。5/23/2020，19，PCR反应5元素优化，1，聚核苷酸引物2，TaqDNA聚合酶3，脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)4，模板核酸5，缓冲液，5/，5/23/2020，21，稳定酶活性为牛血清白蛋白，0.01%明胶，0.050.1%Tween-20和5mmol/L DTT(二巯基硫醇)只有牛血清白蛋白的浓度可以达到800g/ml，没有抑制酶活性。5%到10%的二甲基亚砜有利于DNA变性作用，5%到10%的甘油有利于DNA复性。5/23/2020，22，注意事项，非特异性扩增和交叉污染减少为了防止引物和模板的非特异性结合后的扩增，将反应管和各试剂放在冰上；注意生成气溶胶的样品头的使用，以避免交叉污染。最好加入反应所需的无菌水，依次添加各成分，然后添加聚合酶及模子。5/23/2020，23，PCR产品的检测和分析，凝胶电泳：琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳区分小于300b的DNA片段，5/23/2020，24，5/23 在1.4%和2%琼脂糖凝胶电泳中，迁移率分别类似于1Kb、0.6Kb、0.2Kb和0.15Kb的双链线性DNA片段。 二甲苯腈在1%和1.4%琼脂糖中电泳时，以类似于2Kb和1.6Kb双链线性DNA的移动速度扩散的蔗糖或甘油，导致样品比重增加，DNA均匀沉淀在样品孔中，减少扩散，5/23/2020，27，核酸染色剂，溴b锭染色：溴常用的最终浓度为0.5g/ml，根据情况，可以在制作粘合剂时添加，也可以在电泳后10 15分钟将凝胶浸入该浓度的溶液中染色。染色后，核酸电泳带肉眼可见的话，DNA的量通常为5ng，如果将蛋溴化太多，凝胶底部染色太深，药青带看不清的时候，用蒸馏水浸泡30分钟后观察即可。溴化埃怪是致突变物质，使用时要戴手套，避免环境污染。5/23/2020，28，银染：银染液中的银离子(Ag)与核酸形成稳定的复合物，然后还原Ag为甲醛等还原剂，使核酸带黑棕色，主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色，也用于琼脂凝胶染色其灵敏度比exabyte高，但缺点是银染后DNA回收再利用不好。5/23/2020，29，PCR污染和对策，污染原因(1)PCR放大产物污染最主要的污染问题(2)样本间交叉污染3354主要是标本间的容器被污染，类似总污染导致样本间污染，部分微生物标本，部分，5/23/2020，31，原则上4个不同的工作领域试剂保管和准备区；标本准备区；扩增反应混合物的制备和扩增区域；放大产物分析区。，5/23/2020，32，PCR分类，对称底漆系统PCR1，经典PCR2，嵌套PCR3，多个PCR4，膜耦合PCR5，in situ PCR，5/23/2020，33两个引物的浓度大相径庭(50-100:1)，低浓度称为限制引物，高浓度称为非限制引物，在最初的十几个周期中，两个DNA的目的片段以相同的量扩增，但后来限制引物消耗掉，只剩下非限制引物，扩增产物主要是由该引物领导的单链DNA。不对称PCR主要用于序列分析，以单链DNA、5/23/2020，34、反转录PCR、RNA为模板的PCR称为反转录PCR (reversetransscriptasepar，rt-PCR)逆转录PCR的模板可以是细胞、病毒的总RNA或细胞mRNA，通常用于检测RNA病毒或研究真核细胞的基因表达，5/23/2020，35，标记引物PCR，使用荧光素、同位素或生物素等，研究PCR引物的5 或者结合生物素-亲和素系统和酶反应，利用酶反应的扩增效果表明目标片段的存在，进一步提高PCR的敏感度。5/23/2020，36，不同的荧光素标记不同的引物-彩色PCR-elisa方法-引物的5 端，因此为了携带便于将PCR产品固定在生物素等微孔板上的功能性组；另一个引物或探针的5端修饰可以诱导PCR的特定放大反应，如通过酶联免疫吸附试验容易检测的组FITC，扩增的产品通过生物素和链霉素的反应将产物和生物素修饰玻璃引物固定在微孔板上，与随后添加的HRP- FITC抗体结合，酶将与被检查物相对应的单克隆抗体首先吸附在固体体上，然后对被检查抗原做出反应，通过生物素化特异性多抗耐药结合该抗原，通过亲疏分子与生物素化DNA联系，然后用适当的引物扩增DNA指示分子，放大产物的有无和量，5/23/2020，38，定量PCR，5/23/2020，40，1。Ct值的定义在荧光定量PCR技术中具有非常重要的概念Ct值。每个反应管的荧光信号达到设置的域值时所经历的循环数。5/23/2020，41，2。threshold的设定PCR反应的前15个周期的荧光信号作为荧光背景信号，5/23/2020，42，3。Ct值与启动模板之间的关系每个模板的Ct值与该模板开始副本数的日志具有线性关系，启动副本数越多，Ct值越小。使用被称为起始副本数的标准，水平坐标可以创建表示起始副本数代数、纵坐标代Ct值的标准曲线。因此，当获得未知采样的Ct值时，将在标准曲线上计算该采样的起始副本数。5/23/2020，43，泰qman荧光探针：在PCR放大时添加特定荧光探针，与引物对一起显示寡核苷酸。探针完成后，报告组发出的荧光信号被淬火机吸收。PCR扩增时，Taq酶的5-3 外体酶活性分解探针酶，使报告荧光组和淬火荧光组分离，荧光监测系统接收荧光信号。也就是说，每条扩增的DNA链形成一个荧光分子，荧光信号累积和PCR产物形成完全协调。5/23/2020，44，在PCR反应系统中添加了过多的SYBR荧光染料，在DNA双链中特别混合了SYBR荧光染料，没有混合在链中的SYBR染料分子释放出不释放任何荧光信号的荧光信号，从而使荧光信号的增加和PCR产品的增加完全协调。5/23/2020，45，5/23/2020，47，荧光定量基准曲线，5/23/2020，48，摘要，细菌性食物中毒判断的重要诊断标准主