生物实验技术：第二章 固定与固定剂

第二章固定与固定剂,固定（fixation）：,借助于化学药品的作用，使细胞立即死亡，以保存活细胞所具有的形态和化学成分。,固定剂（fixative）：,第一节固定,固定所用的化学试剂称为固定剂。,第二章,第一节固定,一、固定的意义（目的）,1.保存细胞的形态，防止组织自溶与腐败。,2.保存细胞的化学成分，并原位固定。,3.使组织容易染色，并有利于区别不同的组织成分。,4.保存组织与细胞的抗原性与酶活性，不发生弥散与丢失。,固定是制片的首要关键！,第二章,第一节固定,二、固定方法,1.浸泡固定法：,适用于大部分标本,2.蒸气固定法：,适用于可溶性物质、小而薄的标本、某些薄膜组织及血液或细胞涂片,锇酸或甲醛蒸气；冷冻干燥组织用三聚甲醛蒸气,3.注射、灌注固定法：,4.微波固定法：,组织体积过大或固定剂难以渗透,严格控制固定时间和温度,不用于小块活检材料的固定,！,第二章,第一节固定,三、固定材料时应注意事项,1.材料必须新鲜。,2.材料部位要具有代表性，注意切向。,3.刀锋利，动作迅速仔细，避免材料受损。,4.据所用固定液决定材料块大小。,5.用生理盐水冲洗带污物的组织，如血或沙子（肠内）。,哺乳类0.9%，鸟类0.75%，两栖类0.65%，无脊椎动物0.4-0.45%，鱼类0.7%或0.8%,6.易缩变形材料可贴到卡片纸上固定，如：神经、纽虫等。,7.固定液的量要充足；酶组化材料注意固定温度。,8.掌握合适的固定时间；固定充分。,GotoNo7,单柱上皮不同方位的切片图,第二章,第二节固定剂的类别与固定原理,蛋白质,对沉淀作用,有,无,凝结性固定剂,非凝结性固定剂,乙醇、苦味酸、冰醋酸、氯化汞、铬酸,甲醛、重铬酸钾、四氧化锇(锇酸)、戊二醛,固定剂的类别：,第二章,第二节固定剂的类别与固定原理,一、固定剂对细胞的作用原理,固定剂与蛋白质起了化学上的结合，改变了分子结构而产生沉淀。,如：多数凝结性固定剂。,2.固定剂对蛋白质的变性作用。,如：酒精固定。,3.使蛋白质凝胶化。,固定剂与蛋白质起了化学上的结合，改变了分子结构，但不产生沉淀。呈凝胶状,如：非凝结性固定剂。,蛋白质沉淀成颗粒状、网状、片状形态,第二章,第二节固定剂的类别与固定原理,二、固定剂对组织的穿透作用（穿透率）,固定剂对组织的穿透深度（距离）与固定液作用时间的平方根成正比,根据不同固定剂，掌握适当的固定时间，切取大小适宜的组织块。,例：P10表2-1，表2-2,表2-18种固定剂的穿透系数,重铬酸钾、冰醋酸穿透最快；乙醇、甲醛、氯化汞次之；苦味酸、锇酸、铬酸渗透力很弱,表2-2两种混合固定液的穿透系数,第二章,第二节固定剂的类别与固定原理,三、固定后组织体积上的变化,多数固定剂均能引起组织体积上的变化。表2-3，表2-4,四、组织在固定后的物理性质,组织在固定后一般均能变硬，且有一定弹性。,乙醇：过分硬化组织甲醛、氯化汞：均能硬化组织铬酸、四氧化锇、重铬酸钾：对组织硬化较弱醋酸：软化组织，特别是纤维性组织。,Go15,五、固定对组织的媒染效果,不同固定剂的媒染效果不同。如：氯化汞、锇酸,表2-3Besg用6种固定剂固定了哺乳动物整个肝脏，经酒精或石蜡处理后在体积上的变化,苦味酸、铬酸、乙醇使组织收缩较大；氯化汞变化较少；甲醛、重铬酸钾固定后，体积基本不变。醋酸使材料膨胀。,第二章,表2-4E.wustenfeld用几种不同的固定液固定肌肉、肾、脾、肝后在体积上的改变,同一种固定剂对不同组织所引起的体积变化可能不同不同的固定剂对同一种组织器官所引起的体积变化不同,back,据材料的性质选用不同的固定剂,第二章,第二章,第三节固定剂及其混合固定液,、乙醇及其混合固定液,性质：,沸点80左右，能与二甲苯、水以任意比互溶,还原剂，不与氧化剂铬酸、重铬酸钾、锇酸等混合使用,酒精：Alcohol（Alc）（95%或100%；工业、医用、试剂酒精）,对细胞的作用：,凝结白蛋白和球蛋白，对核蛋白凝结较弱,能溶解大部分脂肪、类脂质和多数色素,能保存肝糖，但其沉淀会在水中丢失,组织在70%酒精中可长期保存。80%Alc中可过夜,用95%工业（医用）酒精配梯度酒精:如：用95%Alc配制30%Alc，取95%Alc30ml，加蒸馏水至95ml,第二章,第三节固定剂及其混合固定液,、乙醇及其混合固定液,梯度酒精的配制：,配方：无水乙醇：冰醋酸=3：1或无水乙醇：氯仿：冰醋酸=6：3：1,例：Carnoy氏液,适用范围：用于细胞学研究，固定细胞核、染色质、染色体。动植物细胞分裂材料均可。,如：水产动物生殖细胞的发育、多倍体鉴定中的染色体材料的固定。多糖类物质等,固定液中各成分的作用：无水乙醇：固定细胞质及肝糖冰醋酸：固定细胞核、染色质及染色体，防止组织因酒精引起的收缩与硬化。,第二章,第三节固定剂及其混合固定液,、乙醇及其混合固定液,斑马鱼,大鳞大马哈,二、甲醛及其混合固定液,第二章,第三节固定剂及其混合固定液,HCHO,性质：,沸点-19，无色气体，易挥发，饱合甲醛溶液又称福尔马林（Formalin），浓度36-40%。,实验室常用10%甲醛；幼小个体用5%。固定海产动物用过滤海水配制。,还原剂，一般不与铬酸、重铬酸钾、锇酸等混合使用。,易氧化成甲酸和聚合成多聚甲醛。酸性影响核的染色，用吡啶、碳酸镁或碳酸钙等中和。,（1）100ml10%甲醛中加ml吡啶，pH7.0；（2）过量的碳酸钙中和，pH6.4；过量碳酸镁中和，pH7.6。（3）100ml10%甲醛中加4gNaH2PO4H2O，6.5gaHPO，pH接近，可长期保持中性。,二、甲醛及其混合固定液,第二章,第三节固定剂及其混合固定液,HCHO,固定细胞核，可保存脂肪、类脂质、神经、髓鞘等。大型标本的最好保存剂。,适用范围：,福尔马林色素：,处理方法：（1）苦味酸饱合液。（2）70%Alc中加0.51%氨水，处理切片30min以上。（3）100ml80%Alc中加1%NaOH1ml，处理10min。,肝、脾等多血的组织中,Goto20,福尔马林色素,back,二、甲醛及其混合固定液,第二章,第三节固定剂及其混合固定液,HCHO,例：1酒精甲醛液（简称液）95%Alc90ml甲醛10ml固定-h，直接进入95AlcBaker氏甲醛钙液（FCa)中性甲醛10ml蒸馏水80ml10%氯化钙10ml,三、苦味酸及其混合固定液,第二章,第三节固定剂及其混合固定液,性质：,强酸，空气中可自燃，密闭时会爆炸，保存于20水中。,水中溶解度1.2-1.4，酒精、二甲苯中溶解度较大。一般用饱和苦味酸水溶液。海产标本用过滤海水配制。,媒染效果好。但固定过久，其强酸性会影响苏木精等碱性染料的染色。,三、苦味酸及其混合固定液,第二章,第三节固定剂及其混合固定液,凝结蛋白质，对核蛋白凝结较弱；保存肝糖；能溶解肌腱粘蛋白，软化结缔组织、腱及皮肤。对脂肪、类脂质无固定作用；多卵黄卵胚在固定后的处理过程中会变得硬脆，切片时卵黄会产生裂隙或成粉末，要缩短固定时间。,对细胞的作用：,三、苦味酸及其混合固定液,第二章,第三节固定剂及其混合固定液,例：Bouin（波恩）固定液饱和苦味酸75ml甲醛25ml冰醋酸5ml,（现用现配）,用途：原生动物、无脊椎动物、纤维组织、动物卵胚及细胞分裂材料的固定。一般材料均可。,苦味酸：凝结所有蛋白质，对核蛋白凝结较弱。醋酸：能很好地凝结核蛋白，同时均衡苦味酸造成的收缩。甲醛：穿透快，对细胞质有较好的凝聚效果。,固定液中各成分的作用：,第二章,第三节固定剂及其混合固定液,四、氯化汞及其混合固定液,性质：,剧毒药品，常温下能升华，故称升汞。对粘膜有刺激性，能腐蚀金属。,水中溶解度6.6-7.1%。能溶于乙醇与苯中。一般用饱和升汞水溶液（pH3.2）。,组织经升汞固定后，产生梭状和不规则状汞盐沉淀，在切片中呈黑色影响观察，必须进行去汞处理。,汞盐沉淀,水洗,（1)组织块去汞法：,70%Alc+碘酒,(2)切片脱汞法：,70%Alc+碘酒,水洗,5%Na2S2O3,5-10min,脱汞（去汞）：,第二章,能凝结一切蛋白质（包括核蛋白）。将细胞质固定成细微颗粒状沉淀。细胞核凝结的最明显，是很好的核固定剂，也是最理想的固定剂之一。对脂类和糖无固定作用，也无破坏作用。,第二章,第三节固定剂及其混合固定液,四、氯化汞及其混合固定液,对细胞的作用：,1.Heidenhain氏Susa”液（1916）氯化汞45g氯化钠0.5g蒸馏水80ml三氯醋酸2g冰醋酸4mlFormalin20ml,第二章,第三节固定剂及其混合固定液,四、氯化汞及其混合固定液,例：,（海德汉）,（苏珊）,结缔组织内分泌腺MalloryAzan三色染色法含三氯醋酸和氯化钠，对硬的组织特别有用，如皮肤、蛔虫、昆虫、幼虫等角层厚的组织。,第二章,第三节固定剂及其混合固定液,四、氯化汞及其混合固定液,2.适合于藻类（特别是微藻）的固定液氯化汞4g醋酸5ml甲醛5ml50%Alc或水100ml,固定微小藻类，小型藻的纤毛（鞭毛）也可显出。团藻属材料。,用甘油、甘油胶或松脂醇封藏材料时,制作石蜡切片时,团藻,杜氏藻,第二章,五、铬酸（H2CrO4）及其混合固定液,第三节固定剂及其混合固定液,性质：,由三氧化铬溶解于水而成，弱酸，强氧化剂，一般不与酒精等还原剂混合使用。但有时与甲醛合用，用前混合。,三氧化铬在水中溶解度62.4%，极易吸水潮解，需密封保存。一般配制1/100的水溶液为贮备液。,固定组织时宜贮暗处以免蛋白质溶解。,只有铬酸才固定肝糖使之不溶于水。,对细胞的作用：,第二章,五、铬酸（H2CrO4）及其混合固定液,第三节固定剂及其混合固定液,主要用于动植物细胞学研究。,可凝结所有蛋白质，对细胞核凝结较好，使DNA凝结成为不溶性；能使细胞质、细胞核固定得非常均匀。,对脂肪与类脂质作用不详。,在线粒体、高尔基体、染色体的固定液中均含有铬酸。,第二章,1.Nawaschin（纳瓦兴）液,五、铬酸（H2CrO4）及其混合固定液,第三节固定剂及其混合固定液,例：,固定24h，流水冲洗6-12h，经5%，10%，15%，20%，30%，40%，50%等酒精脱水，每级4-6h。70%Alc中保存。,植物细胞学材料,第二章,五、铬酸（H2CrO4）及其混合固定液,第三节固定剂及其混合固定液,2.铬醋酸固定液,例：,弱液：用于藻类、菌类、蕨类植物原叶体；中液：用于根尖、小子房的胚珠等；浓液：用于茎、木材、坚韧的叶子、成熟的子房等,植物分裂材料,六、重铬酸钾及其混合固定液K2r2O7,第二章,第三节固定剂及其混合固定液,非凝结性固定剂，固定类脂质、线粒体、高尔基体。不凝结核蛋白，能溶解染色质，对核固定不良。对糖无固定作用。,性质：,水中溶解度约为10，不溶于无水酒精。水溶液略带酸性。,强氧化剂，一般不与还原剂酒精、甲醛等混合保存。,在重铬酸钾溶液中加入醋酸，其作用完全同铬酸。,酸化的重铬酸钾：使细胞质和细胞核沉淀成网状，染色质被保存，线粒体遭破坏。,重铬酸钾：使染色质溶解，染色质无网状结构出现，细胞质固定均匀，线粒体保存下来。,六、重铬酸钾及其混合固定液K2r2O7,第二章,第三节固定剂及其混合固定液,（铬酸）,凝结性固定剂,非凝结性固定剂,Zenker（辛克）氏液Zenker原液：重铬酸钾2.5g氯化汞硫酸钠1g蒸馏水100ml用前加冰醋酸5ml。,六、重铬酸钾及其混合固定液K2r2O7,第二章,第三节固定剂及其混合固定液,例：,铬酸,各成分在固定液中的作用：,氯化汞与铬酸是蛋白质的凝结剂；醋酸与氯化汞是染色质的凝结剂；铬酸能防止氯化汞的过分硬化组织。醋酸能减少铬酸造成的收缩，并抵消铬酸穿透慢的作用。硫酸钠起渗透作用。,5g,第二章,第三节固定剂及其混合固定液,七、四氧化锇（锇酸）及其混合固定液OsO4,性质：,1g或0.5g,水溶液呈中性；蒸气有毒，能损害眼睛及粘膜。常用浓度，一般配贮存。,强氧化剂，不能与酒精、甲醛混合保存。其水溶液极易被有机物还原成黑色（氢氧化锇），配好后密封瓶口，于冰箱中暗处保存。,穿透速度很慢，有固定不均匀的缺点，组织块要尽量切小。,锇酸常与铬酸、重铬酸钾混合使用。,使蛋白质呈均匀的凝胶状，在电镜下也是均匀的，是一种良好的电镜材料固定剂。,锇酸是脂肪和类脂质的唯一良好固定剂，特别适合于线粒体、高尔基体的固定，固定成黑色沉淀，不溶于酒精及苯，但稍溶于二甲苯，制片时用苯代替二甲苯可得优良效果。,第二章,第三节固定剂及其混合固定液,七、四氧化锇（锇酸）及其混合固定液OsO4,性质：,八、醋酸（冰醋酸）,高浓度的醋酸能破坏线粒体和高尔基体，在有关线粒体和高尔基体的固定剂中，一般不含醋酸，即使有也只是几滴。如：Flemming固定液（P21）,第二章,第三节固定剂及其混合固定液,性质：,温度低于16.7时即结冰。与水、酒精以任意比互溶。,冰醋酸不能沉淀细胞质（白蛋白、球蛋白）；能沉淀核蛋白，对染色质的固定很好。,冰醋酸在固定剂中的作用除固定细胞核外，主要是增加固定剂的渗透速度和维持固定剂的平衡。,对脂肪、类脂质无固定作用，也不能保存糖原。,其它固定剂：甲醇、丙酸丙酮戊二醛、丙烯醛等,第二章,第三节固定剂及其混合固定液,1.固定