噬菌体展示技术.ppt

主讲：叶思灵,噬菌体展示技术,什么是噬菌体展示是一项筛选技术，将外源多肽或蛋白与噬菌体的衣壳蛋白融合表达，融合蛋白展示在病毒颗粒的表面，而编码该融合子的DNA则位于病毒粒子内。表型基因型展示肽编码基因,使大量多肽与其DNA编码序列之间建立了直接联系，使各种靶分子（抗体、酶、细胞表面受体等）的多肽配体通过淘选得以快速鉴定,简介,Landmarksofphagedisplay,1985第一次发表噬菌体展示技术；展示多肽SmithGP.Science.1985;228:1315-71988噬菌质粒系统1990抗体片段的展示1993展示cDNA文库1994/1995研发了phagetwo-hybrid技术1996首次体内invivo淘选试验1998噬菌体展示载体作为基因导入载体1999Combinationofphagedisplaywithhigh-densityarrays2001AutomatedphagedisplayselectionKillingcancercellsbytargeteddrug-carryingphagenanomedicinesPublished:3April2008BMCBiotechnology2008,8:37doi:10.1186/1472-6750-8-37,展示系统DisplaySystem,CellBased1、PhageDisplay2、CellSurfaceDisplayCellFree1、RibosomeDisplay2、mRNADisplay,噬菌体展示系统的分类,根据噬菌体不同PhageM13,f1,fdT7,T4,lamda根据载体不同VectorTruePhagePhagemid根据文库不同Library随机肽库、cDNA文库、抗体文库、蛋白质文库,M13噬菌体的组成和结构,丝状噬菌体：M13、f1和fd。单链DNA病毒,6407bp。基因组编码11种蛋白质，其中5种为结构蛋白质。与展示密切相关的有两种结构蛋白质。DNA在细菌内滚环复制，细菌不被裂解，但生长速度减慢，并且分泌大量噬菌体颗粒,LifeCycleofM13,pIII蛋白结合于E.Coli的F纤毛;病毒ssDNA进入细菌的胞浆合成dsDNA；以dsDNA为模版合成所有的病毒蛋白，且通过滚环复制合成组装病毒所需的ssDNA。第一代噬菌体在感染10分钟后出现在培养液中（37）。感染后1小时内平均每个细胞分泌1000个噬菌体。,次要衣壳蛋白pIII,406aa组成，5个拷贝，位于噬菌体的尾部。由三个功能区组成：N1穿膜区：作用于E.coli细胞膜上的TolA蛋白；与噬菌体的入侵有关。N2受体结合区：负责结合F菌毛。CT疏水区：组装前黏附在细菌内膜上；与噬菌体组装终止有关。G1、G2:甘氨酸片段，在感染过程中，增加各个功能域之间的灵活性。,主要衣壳蛋白pVIII,每个病毒子含约2700个拷贝，约10%能有效地融合外源多肽或蛋白。以pIII融合子方式表达的多肽是低价的，而以pVIII融合子方式表达的多肽则是高价的（每个病毒子200个拷贝）。这种高价pVIII展示所增加的亲和力有利于筛选到亲和力非常低的配体，而低价pIII展示则将筛选限制在具有较高亲和力的配体上。所有Ph.D.文库都是pIII融合方式（每个病毒子展示5个拷贝的外源多肽）。,pIII蛋白展示和pVIII蛋白展示有什么不同?,pVIII展示的多肽比较小，如果太大会影响噬菌体壳蛋白的组装。pIII只要不影响感染，可以展示300aa的多肽。噬菌质粒能展示的蛋白已经达到86kDa。丝状噬菌体展示系统一般是在包膜蛋白pIII或pVIII的N端融合外源多肽。每个病毒子含个拷贝的pIII蛋白，这五个蛋白都可以融合短肽而不影响噬菌体的感染力。拷贝数不同。,噬菌体质粒方便克隆、增强遗传稳定性,噬菌体质粒特征：携带有欲在噬菌体上融合展示的蛋白基因，没有其他噬菌体基因。有质粒复制起点(322ori)和噬菌体复制起点(f1ori用于合成ssDNA)。有包装序列信号（packingsignal）。有供筛选的抗生素标记基因。Helperphage：提供噬菌体质粒复制、合成ssDNA和病毒包装所需要的所有蛋白和酶（f1oridefect)。,噬菌体展示技术流程,淘选的方法亲和淘选直接包被法淘选法：优点：简单直接。缺点：偶尔会导致配体结合位点难以进入可能是由于分子的立体封阻或者是靶分子表面的部分变性而引起液相法：先将噬菌体库在液相中与靶分子进行预结合，然后将噬菌体-靶分子复合物亲和捕获于亲和介质上，如：链霉亲和素包被的表面。,建库：例子含编码12肽DNA序列为5CATTCTCACTCGGCCGACGGGGCT(NNK)12GGGGCCGCTGGGGCCCAAACTGTTGAA3，其中N代表A、T、C、G四种碱基，K代表G、T两种碱基，(NNK)12为编码随机12肽部分，划线部分含有Bgl识别序列。扩增-嵌合-噬菌体扩增,亲和淘选,噬菌体肽库与靶分子相互作用洗涤去未结合的或非特异性结合的噬菌体将特异性结合的噬菌体洗脱下来三轮淘选后，克隆测序,噬菌体展示的应用,抗原表位分析制备特异性抗体制备疫苗、多价疫苗构建新型的生物催化剂如Renetal(1997)将T4DNA连接酶展示于T4噬菌体，所表达的融合蛋白能够高效连接黏性或者平末端。有可能把催化某一代谢途径的多种酶展示到噬菌体上，制造人工的多酶复合体。或者把成百上千个酶分子的活性位点展示到同一个噬菌体颗粒上，制造superenzyme。筛选酶抑制剂是寻找抑制酶活性肽段的理想工具。Dennis从肽库中筛选到非竞争性地抑制FVIIa活性的肽段。,噬菌体展示的应用,蛋白质蛋白质相互作用噬菌体cDNA文库与芯片相结合(a)合成噬菌体cDNA文库。(b)生物淘选。(c)铺板，挑克隆入微孔板，为制备芯片做准备。,噬菌体展示的应用应用举例,用病人IgE血清对6种不同的cDNA文库淘选，5轮后，挑出38,000个克隆，鉴别了233种蛋白，其中47种为已知，186种是新的过敏源。烟曲霉(Aspergillusfumigatus)已成为临床上仅次于白色念珠菌的一种重要的条件致病真菌。草本枝孢(小麦黑霉病菌)Cladosporiumherbarum鸡腿蘑（Coprinuscomatus）皮屑牙胞菌(Malasseziafurfur)花生和人肺组织,Crameri,R.etal.(2001)Tappingallergenrepertoiresbyadvancedcloningtechnologies.Int.Arch.AllergyImmunol.124,4347,噬菌体表面展示肽库优缺点,优点：M13无需体外包装电转化效率高,库容量大2.8109M13噬菌体纯化步骤简单，可加速淘选进程可避免细胞蛋白的污染A