荧光定量PCR检测项目ppt课件

荧光定量聚合酶链反应检测项目，乙型肝炎病毒核酸定量乙型肝炎基因分型，乙型肝炎拉米夫定耐药丙型肝炎病毒核酸定量病毒性脑炎，1。实时荧光定量聚合酶链反应方法- TaqMan方法，方法：TaqMan方法-水解杂交探针，5末端标记有荧光报告分子(R)，例如，在FAM、维克等的3末端标记有荧光淬灭基团(淬灭剂、Q)的探针。是完全的，由R发射的荧光能量被Q基团吸收，没有荧光，R和Q被分离，荧光Taq酶具有53 核酸外切酶活性，可水解探针，2，5 ，3 ，5 ，5 ，3 ，5 ，5 ，正向引物，反向引物，Taqman探针，R，Q，Taqman实时PCR反应过程，3，置换，5 ，3 ，5 ，5 ，3 ，5 ，正向引物，反向引物，R，Q，4，水解，5 ，3 ，5 ，3 ，5 5、5、3、5、5、5、R、Q，对于每一个被扩增的DNA分子，都释放出一个荧光信号，在循环的任何一点都可以检测到荧光；6、定义实时荧光定量聚合酶链反应，并在聚合酶链反应反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监控整个聚合酶链反应过程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。 实时原理和常规的聚合酶链反应技术：对聚合酶链反应扩增反应的最终产物进行定量和定性分析，不能准确定量初始模板，也不能实时检测扩增反应。 实时定量聚合酶链反应技术：利用荧光信号的变化实时检测聚合酶链反应每个循环中扩增产物数量的变化，通过Ct值和标准曲线分析对初始模板进行定量分析，8。实时荧光定量PCR的定量原理，如何对初始模板进行定量？通过Ct值和标准曲线对初始模板进行定量分析，引入三个概念：扩增曲线、荧光阈值、Ct值、9、扩增曲线、10、荧光阈值和荧光信号阈值：前15个周期信号作为荧光背景信号。也就是说，样品的荧光背景值和阴性对照的荧光阈值的默认设置是3-15个周期的荧光信号的标准偏差的10倍。原则上，它应该大于样品的荧光背景值和阴性对照的荧光最大值。同时，应尽可能选择指数周期的初始阶段，回归系数大于0.99的实际信号：荧光信号应超过阈值11 Ct值Ct值定义：扩增产物的荧光信号在聚合酶链反应扩增过程中达到设定阈值时的扩增循环数12 Ct值的重现性和Ct值的特征：同一模板扩增96次，终点的产物量不恒定；Ct值具有极高的重现性，13，定量原理，理想聚合酶链反应：X=X0*2n非理想聚合酶链反应：X=X0(1 Ex)nn:扩增反应的循环次数X:第n个循环后的产物量X0:初始模板量Ex:扩增效率，14，定量原理，当： xct=X0(1 Ex)Ct=m(1)xct :的荧光扩增信号达到阈值线时的扩增产物量。阈值线设置后，它是一个常数。让我们假设等式(1)的两边的m同时取对数得到：logM=logX0(1 Ex)Ct(2)整理等式(2)得到： log x0=-log(1 Ex)* Ct log m(3)log浓度与循环次数成线性关系。根据样品膨胀达到结构域值(即Ct值)时的循环次数，可以计算出样品中包含的模板量，15，标准曲线，模板DNA的量越多，荧光达到阈值的循环次数越少，即Ct值越小，对数浓度与循环次数之间的线性关系越好。具有已知初始拷贝数的标准物质可以制成标准曲线。基于样本的Ct值，可以计算样本中包含的模板数量。16.确定未知样品的C(t)值。未知样品的初始量通过标准曲线由未知样品的C(t)值计算得出。绝对用于临床标本采集的容器，如试管或离心管，在使用前应进行高压灭菌并密封。标本采集后，应尽快送至实验室。如果运送时间超过2小时，必须将它们和冰盒一起送到实验室。如果向样品中加入适当的稳定剂，如血清(浆液)样品中加入4摩尔/升异硫氰酸胍(GITC)进行核糖核酸测定，加入乙二胺四乙酸抗凝剂进行脱氧核糖核酸测定，它们可以在室温下运输或邮寄。注：用乙二胺四乙酸抗凝全血样品做核糖核酸，抗凝后6小时内分离血浆，如果用血清样品，尽快(2小时内)分离血清。严禁肝素抗凝。18、定量检测的临床意义，治疗前定量检测病毒，指导抗病毒药物的选择，避免盲目用药。经治疗后，定量聚合酶链反应可以直接、准确地测定体内病毒的数量，有助于判断疗效。孕前定量聚合酶链反应有助于选择有利的妊娠时机。19岁，HBV基因分型。根据HBV核酸的异质性8%，HBV基因型分为8种亚洲类型，主要为b型和c型。HBV感染后的临床病程与不同的基因型有关。20、HBV基因型的临床意义。与基因型b相比，基因型C具有更高的HBeAg阳性率，自发性HBeAg清除率分别为16%和53%，基因型b比基因型C早10年，且在HBeAg清除后肝脏生化指标继续变化。在亚洲的无症状HBV携带者中，与基因型B相比，基因型C在50岁以上的肝硬化和肝细胞癌患者中所占比例较高，而基因型B与50岁以下的患者相关，尤其是35岁以下的患者。当干扰素用于药物敏感性时，基因型B的完全应答率达到基因型C的3倍。当拉米夫定用于HBeAg阳性的乙型肝炎患者时，发现基因型B患者的HBeAg/HBeAb阴性转换率达到基因型C22的2倍。与不同基因型的HBV相比，B型丙型肝炎流行率低，HBeAg阳性率高，HBeAg自然清除时间低，HBVDNA负荷短而长，高致病性轻、重HCC发生率低，干扰素治疗完全缓解率低(低年龄组高)和高(高年龄组高)，抗病毒治疗效果高、低，肝癌外科治疗预后差，肿瘤栓塞治疗效果差，23。注意事项，当病毒定量为103时，检测基因分型更有意义。打字结果可能是阴性的。排除病毒量低的原因，患者的HBV基因型可能是非乙型、丙型、24型、HBV型拉米夫定、庚型。“有效”核苷类高效抗乙型肝炎病毒药物可迅速降低HBV-脱氧核糖核酸的滴度，改善肝组织的病理变化，还可防止纤维化进程，终止肝硬化的发展。长期服用“耐药”会引起HBV基因突变，这将大大降低HBV对药物的敏感性，从而使血清中HBV的复制恢复活性，效价增加。25，耐药机制，突变株y(酪氨酸)m(蛋氨酸)d(天冬氨酸)d(天冬氨酸)在HBV聚合酶中的生物学特性：对拉米夫定抗病毒作用的敏感性下降到1/300，而DNA仅下降1/7。临床症状：血清丙氨酸氨基转移酶水平暂时升高，HBV-脱氧核糖核酸浓度升高，轻度疲劳和恶心等肝脏炎症损害加重。I(异亮氨酸)v(缬氨酸)，26，拉米夫定耐药性，发生率：慢性乙型肝炎治疗6个月后出现耐药性。在接受拉米夫定治疗1年的亚洲慢性乙型肝炎患者中，对拉米夫定敏感性降低的病毒变异发生率达到14%，甚至39%。定义：持续治疗期间血清中HBVDNA复制耐药性的差异：检测灵敏度的基本病毒水平是否为多重/多重抗病毒治疗，27、拉米夫定耐药的临床意义，以及耐药后的临床情况：虽然病毒复制发生在耐药变异后1-4个月内，但患者的情况也可能有很大差异。一些患者携带无症状变异病毒在一些患有野生型转化的患者中停用拉米夫定3-4个月后，突变型菌株具有低复制活性，并且可能被具有较高复制活性的野生型菌株替