现代分子生物学

.,第一章绪论一.基本含义,一.分子生物学的基本含义是人类从分子水平上研究细胞活动的规律，揭开生命本质的一门基础学科。,.,第一章绪论一.基本含义,-分子水平是指携带遗传信息的核酸和在遗传信息传递及细胞内、细胞间通讯过程中发挥着重要作用的蛋白质等生物大分子。-分子水平上研究生命的本质主要是指对遗传、生殖、生长和发育等生命基本特征的分子机理的阐明,从而为利用和改造生物奠定理论基础和提供新的手段。,.,第一章绪论一.基本含义,分子生物学：是研究核酸等生物大分子的功能、形态结构特征及其重要性和规律性的学科，是人类从分子水平上真正揭开生物世界的奥秘，由被动适应自然界转向主动地改造和重组自然界的基础学科。分子生物学是目前现代生物学领域里最具有活力和发展最为迅速的学科之一。,.,第一章绪论二.分子生物学发展简史,二.分子生物学发展简史分子生物学的发展大致可分为两个阶段1.准备和酝酿阶段19世纪后期-20世纪50年代产生了两点对生命本质的认识上的重大突破:确定了生物遗传的物质基础是核酸,解决了遗传的物质基础问题。确定了蛋白质是生命的主要基础物质。,.,第一章绪论二.分子生物学发展简史,2.分子生物学的建立和发展阶段主要进展:50年代提出了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制,解决了遗传物质的自我复制和世代交替问题;50年代末至60年代,提出了“中心法则”和操纵子学说,成功地破译了遗传密码,阐明了遗传信息的流动与表达机制。P.11,.,第一章绪论二.分子生物学发展简史,1957年,A.Kornberg在大肠杆菌中发现了DNA聚合酶;1965年,证明了细菌的抗药性通常由“质粒”DNA所决定；1967年,第一次发现DNA连接酶;1970年,Smith,Wilcox和Kelley分离出第一种限制性核酸内切酶,Temin和Baltimore从RNA肿瘤病毒中发现反转录酶。1972-73年,Boyer,Berg等人发明了DNA重组技术,1972年获得第一个重组DNA分子；1973年完成第一例细菌基因克隆。1978年,首次在大肠杆菌中生产由人工合成基因表达的人脑激素和人胰岛素。,.,第一章绪论二.分子生物学发展简史,1981年,Palmiter和Brinster获得转基小鼠,Spradliing和Rubin得到转基因果蝇。1982年,美、英批准使用第一例基因工程药物胰岛素。1983年,获得第一例转基因植物。1994年,第一批基因工程西红柿在美国上市。1996年,完成了酵母基因组(1.25107bp)全序列测定。1997年,英国爱丁堡罗斯林研究所获得克隆羊。2000年,完成第一个高等植物拟南芥的全序列测定(3.2108bp)。2001年,完成人类基因组全序列测定(3.5109bp)。,.,第一章绪论二.分子生物学发展简史,2002年,英、美、德等国的上百位科学家在Nature杂志上联合宣布他们成功破译了小鼠的基因组。2004年，科学杂志发表了中国科学家的家蚕基因组框架图。2005年，2005年8月11日中、美、日、法等10个国家和地区的科学家在Nature杂志发表了水稻基因组“精细图”，覆盖率达95.3。我国对国际水稻基因组计划的贡献率达20。共定位了37,500个基因，还率先在动植物中完成了对着丝粒的测序。,.,第一章绪论二.分子生物学发展简史,2009年，由中国农科院蔬菜花卉研究所和深圳华大基因研究院领衔、14国科学家组成的国际马铃薯基因组测序协作组，分别在北京、阿姆斯特丹、伦敦、纽约、利马等地同时宣布：马铃薯基因组序列框架图完成马铃薯基因组有12条染色体、8.4亿个碱基对该框架图覆盖了:马铃薯95以上的基因共发现3.5万多个基因,.,第一章绪论二.分子生物学发展简史,2009年，中国颁发了具有自主知识产权的:一个转植酸酶基因玉米品种生产应用安全证书两个转抗虫基因水稻品种,.,第一章绪论二.分子生物学发展简史,转植酸酶基因玉米:可以提高饲料的利用效率，减少饲料中磷酸氢钙的添加量，降低饲养成本；减少动物粪、尿中植酸磷的排泄，减轻环境污染，有利于环境保护.此外，利用农业种植方式生产植酸酶，还具有节能、环保、低成本的优势。植酸酶:是催化植酸及其盐类水解为肌醇与磷酸（盐）的一类酶的总称,.,第一章绪论二.分子生物学发展简史,转抗虫基因水稻:能有效控制螟虫等鳞翅目害虫危害，保障水稻增产，还能减少80%的化学农药用量。,.,第一章绪论三.分子生物学的主要研究内容,分子生物学的基本原理（p11)构成生物体各类有机大分子的单体在不同生物中都是相同的。(2)生物体内一切有机大分子的建成都遵循共同的规则。(3)某一特定生物体所拥有的核酸及蛋白质分子决定了它的属性。,.,第一章绪论三.主要研究内容,2.主要研究内容(1）DNA重组技术（2）基因表达调控研究（3）结构分子生物学（4）基因组、功基因组与生物信息学研究,.,分子生物学的研究内容DNA重组技术,（1）DNA重组技术（基因工程/遗传工程/基因操作/基因克隆/分子克隆）在体外将不同的DNA片段(整个基因或基因的一个部分)按照人们的设计定向连接起来后，转入特定的受体细胞，使重组基因在受体细胞中与载体同时复制并得到表达，从而赋予生物体新的遗传特性,创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。,基因（gene）：产生一条多肽链或功能RNA所需要的全部DNA序列.,.,GAATTCCTTAAG,SV40,GAATTCCTTAAG,SV40病毒DNA,噬菌体DNA,EcoRI,DNAligase连接,SV40,GAATTCCTTAAG,SV40,DNA,GAATTCCTTAAG,DNA,VS40,GAATTCCTTAAG,GAATTCCTTAAG,SV40,53,53,切割,图:SV40病毒DNA和噬菌体DNA的重组,例1:,例2:,.,分子生物学的研究内容DNA重组技术,DNA重组操作主要包括:DNA(基因组和质粒DNA)提取和纯化PCR(聚合酶链反应)基因扩增DNA聚合酶DNA分子切割限制性内切酶DNA片段与载体连接DNA连接酶DNA凝胶电泳细胞转化及重组子的筛选与鉴定等,.,分子生物学的研究内容DNA重组技术,三大基本工具:“分子手术刀”限制性核酸内切酶“分子缝合针”DNA连接酶“分子运输车”基因进入受体细胞的载体,.,分子生物学的研究内容DNA重组技术,DNA重组技术应用前景可用来进行基因功能的研究。如利用反义技术、RNA干扰等技术。可用于定向改造某些生物的基因组结构。如：转基因Bt抗虫棉，将苏云金芽孢杆菌编码Bt毒蛋白的抗虫基因转入棉花后获得的。可用于大量生产某些在正常细胞代谢中产量很低或不能产生的多肽，如激素、抗生素、酶类和抗体等，提高产量，降低成本。,.,分子生物学的研究内容基因表达调控研究,基因表达(geneexpression):从DNA到蛋白质或功能RNA的过程被称为基因表达。实质上就是遗传信息的转录和翻译,基因表达调控(generegulation)：对基因表达过程的调节就称为基因表达的调控。,(2)基因表达调控研究,.,分子生物学的研究内容基因表达调控研究,DNARNA,反馈(?),转录,复制,翻译,蛋白质,生理功能,图:遗传信息传递的“中心法则”示意图（21世纪后修正的）,tRNA和rRNA,小RNA（microRNAs）,非编码RNA（Non-codingRNA）,P.11,.,分子生物学的研究内容基因表达调控研究,基因表达调控类型:时序调控(遗传特性)区域调控(遗传特性)环境调控(内外环境变化)基因表达过程中的调控主要发生在：DNA的转录水平(原核生物和真核生物)RNA的翻译水平(此调控仅发生在真核生物的基因表达中),.,分子生物学的研究内容结构分子生物学,（3）生物大分子的结构功能研究结构分子生物学一个生物大分子，无论是核酸、蛋白质等在发挥其生物功能时，必须具备两个提：拥有特定的空间结构（三维结构）；发挥生物学功能的过程中必定存在着结构和构象的变化。,.,分子生物学的研究内容结构分子生物学,结构分子生物学就是研究生物大分子特定的空间结构及结构的运动变化与其生物学功能关系的科学。主要包括三个研究方向：结构的测定采用X射线衍射、二维或多维核磁共振等方法结构运动变化规律的探索结构与功能相互关系的建立,.,分子生物学的研究内容基因组、功能基因组与生物信息学研究,（4）基因组、功基因组与生物信息学研究基因组（genome):生物有机体的单倍体细胞中的所有DNA，包括核中的染色体DNA和线粒体、叶绿体等亚细胞器中的DNA。P.456,.,分子生物学的研究内容基因组、功能基因组与生物信息学研究,基因组计划:测定基因组序列。-人类基因组计划目的是揭开人类所有的遗传结构,包括所有的基因(尤其是与疾病相关的基因)和基因外序列的结构。1990年-2001年，美、英、法、德、日、中6国的合作已完成人类基因的全部序列测定工作。见表2-1,P.19.-小家鼠、果蝇、线虫、拟南芥、水稻、啤酒酵母，以及多种真菌、细菌的基因组研究相继展开，其中拟南芥基因组的全序列测定已完成。,.,分子生物学的研究内容基因组、功能基因组与生物信息学研究,功能基因组计划(蛋白组计划或后基因组计划):揭示基因产物和功能之间的关系。通过利用各种模式植物体基因的剔除和转基因来研究基因的功能。生物信息学:将基因的结构、蛋白质功能以及物种的进化在基因信息的基础上统一起来。p.15,.,第一章绪论四.课程学习目的和内容,学习目的:掌握分子生物学的基本概念、基本原理、基本操作技术等。学习内容:重点讲授第三章生物信息的传递(上)-从DNA到RNA第四章生物信息的传递(下)-从RNA到蛋白质第五章分子生物学研究法（上）第六章分子生物学研究法（下）第七章基因的表达与调控(上)-原核基因表达调节模式第八章基因的表达与调控(下)-真核基因表达调控的一般规律,.,第一章绪论四.课程的学习目的和内容,参考书:吴乃虎主编杨岐生主编浙江大学出版社3.吴乃虎主编,.,第一章绪论,当你进入实验室时,要像脱去外衣那样放下你的想像力,因为实验操作中不能有一丁点的想像,否则,你对事物的观察就会受影响;而当你翻开书本的时候,你又必须尽可能展开想像的“翅膀”,否则,你就不可能走在别人前面。朱玉贤,.,第二章染色体和DNA一.染色体,染色体:细胞(核)中由DNA、蛋白质组成的易被碱性染料着色的一种丝状或杆状物。亲代是以染色体的形式将自己的遗传物质DNA传给子代，保持了物种的稳定性和连续性。因此，染色体在遗传上起着主要作用。,.,第二章染色体和DNA一.染色体,染色体的特征:(1)分子结构相对稳定;(2)能够自我复制，亲代能够将自己的遗传物质DNA以染色体的形式传给子代,使亲、子代之间保持了物种的稳定性和连续性;(3)能够指导蛋白质的合成，从而控制整个生命过程;(4)能够产生可遗传的变异。,.,第二章染色体和DNA一.染色体,2.染色体的组成(1)原核细胞染色体由DNA与非组蛋白质组成，两者结合呈松散状态。参与DNA折叠染色体中的蛋白质参与DNA复制、重组及转录原核生物染色体一般位于类核体上。,.,第二章染色体和DNA一.染色体,原核生物类核的结构p.22,.,第二章染色体和DNA一.染色体,原核生物基因组的特点：多数只有一条染色体基因组小大肠杆菌基因组仅含4000多个基因。DNA含量少大肠杆菌DNA的相对分子质量只有2.4109,.,第二章染色体和DNA一.染色体,原核生物DNA的主要特点:p.30结构简练大多数为单拷贝基因,只有很少数基因（rRNA）是以多拷贝形态存在。原核DNA分子的绝大部分是用来编码蛋白质的，只有非常小的一部分不转录。而且，这些不转录DNA序列通常是控制基因表达的序列。存在转录单元（操纵子）原核DNA序列中功能相关的RNA和蛋白质基因，往往丛集在基因组的特定部位，形成功能单位或转录单元，它们可被一起转录为可翻译多个蛋白质的mRNA分子，这种mRNA叫多顺反子mRNA。,.,第二章染色体和DNA一.染色体,有重叠基因具有部分共用核苷酸序列的基因，也就是说，同一段DNA携带了两种不同蛋白质的编码信息。这样的两个基因称之为重叠基因。重叠的部分可以在基因的调控区，也可以在结构基因区。重叠基因主要有以下几种情况:一个基因完全在另一个基因里面;部分重叠;两个基因只有一个碱基对的重叠。,.,第二章染色体和DNA一.染色体,噬菌体X174P.31,.,第二章染色体和DNA一.染色体,真核细胞染色体的组成组蛋白蛋白质染色体非组蛋白,DNA,少量RNA（主要是尚未完成转录而仍与模板DNA相连的那些RNA）,(2)真核细胞染色质与染色体,.,第二章染色体和DNA一.染色体,蛋白质组蛋白(histone，H)染色质中的蛋白质非组蛋白(nonhistonechromosomalproteins,NHC)真核染色质中蛋白质与相应DNA的质量比约为2:1。,.,第二章染色体和DNA一.染色体,组蛋白一类小分子量的碱性蛋白质，是构成真核染色质的主要蛋白质。真核生物的染色质中有H2A、H2B、H3、H4和H1(鸟类、鱼类及两栖类红细胞染色体不含H1而带有H5)等5种主要类型的组蛋白。,.,第二章染色体和DNA一.染色体,表真核细胞染色质上的组蛋白成分分析seeP.23.表2-5._种类相对分子质量氨基酸数目分离难易度保守性染色质中比例染色质中位置_H121000223易不保守0.5接头H2A14500129较难较保守1核心H2B13800125较难较保守1核心H315300135最难最保守1核心H411300102最难最保守1核心_-H3、H4富含精氨酸H1富含赖氨酸H2A、H2B介于两者之间-用2mol/LNaCl或0.25mol/L的HCl/H2SO4处理染色质，可将组蛋白与DNA分离。,.,第二章染色体和DNA一.染色体,组蛋白的特性：p.24进化上的极端保守性,组成相似,特别是H3、H4.对稳定染色体结构起作用。无组织特异性,仅有两个列外。肽链上氨基酸分布的不对称性,碱性AA集中分布在N-端的半条链上,与DNA的负电荷区结合,大部分疏水基团集中分布在C-端的半条链上,与其它组蛋白、非组蛋白结合.组蛋白的修饰作用,主要为甲基化、乙酰化、磷酸化等,可调控基因表达。H5的磷酸化对染色质失活起作用。,.,第二章染色体和DNA一.染色体,非组蛋白:是一类多种蛋白质的群体,大约100种,常见15-20种,占染色体蛋白总量的60-70%.HMG蛋白(highmobilitygroupprotein,高速泳动蛋白)特性:-小分子量，高电荷;-通常与有能力进行转录的活性染色质特异性结合;-可用0.35mol/LNaCl溶液提取，能溶于2%的三氯乙酸。功能:与DNA的超螺旋结构有关。DNA结合蛋白特性:-能与DNA紧密结合;-只有用高浓度盐液提取，通常采用2mol/LNaCl或5mol/L尿素溶液。功能:参与DNA的复制或转录。,.,第二章染色体和DNA一.染色体,A24非组蛋白小鼠肝脏中分离到一种蛋白质。氨基酸序列测定发现A24的C端与H2A相同，A24它有两个N端，一个N端的序列与H2A相同，另一个N端与泛蛋白相同，A24位于核小体内，功能不详。泛蛋白：在真核细胞中普遍存在的小分子量的蛋白质。可以修饰核小体结构，与H2A组蛋白发生共价连接，形成修饰的uH2A组蛋白。,.,第二章染色体和DNA一.染色体,真核细胞基因组的特点p.29-真核基因组宠大,人类基因组的总长度为2907Mb，含39114个基因。-含有大量重复序列。-含有大量的非编码序列，占整个基因组序列的90%（C值-一种生物单倍体基因组DNA的总量。p25）。-真核基因绝大多数为断裂基因。-真核基因的转录产物为单顺反子。-真核基因组中存在大量的顺式作用元件.包括启动子、增强子、沉默子等。-真核基因组中存在大量的DNA多态性。-真核基因组具有端粒结构。是真核生物线性基因组DNA末端的一种特殊结构，是一段DNA序列和蛋白质形成的复合体，具有保护线性DNA的完整复制等功能。,.,第二章染色体和DNA一.染色体,真核生物DNA序列真核生物DNA序列可分为三类:不重复序列(uniquesequence):在单倍体基因组内,这些序列仅出现一次或少数几次。占DNA总量的40-80%,在人类基因组中占60-65%。结构基因属于不重复序列。中度重复序列(moderatelyrepetitivesequence):序列的重复次数为103-105,占DNA总量的15%。各种rRNA、tRNA和一些结构基因，如非洲爪蟾的rRNA基因都属于这类。P.26,.,第二章染色体和DNA一.染色体,高度重复序列(highrepetitivesequence):序列的重复次数在105以上,不转录。主要为卫星DNA(又称随体DNA)。卫星DNA:因为这种DNA含大量的A、T碱基，浮力密度小,在CsCl密度梯度超离心时形成一条与DNA主带相伴的小带,形似卫星而得名。仅存在于真核生物DNA列。,.,第二章染色体和DNA真核生物的DNA序列,C值(C-value):一种生物单倍体基因组的DNA总量(P.25)。C值反常现象(C值悖理,C-valueparadox):物种的C值和它进化复杂性之间不存在严格的对应关系,这一现称为C值反常现象。*C值反常现象暗示着真核生物基因组中必然存在大量的不编码基因产物的DNA序列。,.,第二章染色体和DNA一.染色体,断裂基因(splitgene):真核基因是不连续排列的，在编码多肽链的DNA序列中间插入与氨基酸无关的DNA序列。一个基因编码序列被分隔成不连续的若干区段。编码序列:外显子(exon)编码序列中间的插入的非编码序列:内含子(intron)不连续基因是由外显子和内含子交替排列组成。内含子存在于转录的初始产物中，在基因产物成熟翻释之前必须被切除，切除的过程称为RNA的剪接。一般说来，剪接包括从初始转录产物精确地去掉内含子，然后切点两侧的RNA末端重新连接，外显子形成共价的完整分子。,.,第二章染色体和DNA一.染色体,图:鸡蛋清蛋白基因的不连续性及与mRNA形成R-环。,.,第二章染色体和DNA一.染色体,染色体的结构核小体结构在细胞生活周期的大部分时间里都以染色质的形式存在。染色质是一种纤维状结构的细丝,又称为染色质丝,它的基本结构单位是核小体。,.,第二章染色体和DNA一.染色体,核小体中由各两个分子的组蛋白H2A、H2B、H3和H4组成的一种圆盘状的蛋白质核心,这个核心被称之为组蛋白八聚体或核小体核心。H2A、H2B、H3、H4称为核心组蛋白(corehistone)DNA双螺旋分子以146bp的长度盘旋1.8圈的形式缠绕在组蛋白八聚体的外周，形成核小体核心颗粒。H1(H5)称为连接组蛋白(linkerhistone)相邻的两个核小体核心颗粒之间，有一段长60bp的连接DNA，连接DNA加上核小体核心颗粒便构成了核小体。,.,MOV：MCB4.0threedimensionalpackingofnuclearchromosomes,2(H2A、H2B、H3、H4),.,.,第二章染色体和DNA一.染色体,核小体结构的修饰在细胞周期特定时间，核小体中的组蛋白可发生甲基化、乙酰化（p28，图2-7）、磷酸化、ADP核糖基化等修饰。H3、H4修饰作用较普遍，H2B有乙酰化作用、H1和H5有磷酸化作用。修饰作用的共同特点：是降低组蛋白所携带的正电荷。组蛋白修饰的意义：一是改变染色体的结构，直接影响转录活性；二是核小体表面发生改变，使其他调控蛋白易于和染色质相互接触，从而间接影响转录活性。,.,第二章染色体和DNA一.染色体,染色质与转录活性:染色质的类型根据染色质的活性状态，可分为：真核基因组DNA被蛋白质包装形成染色质，其中的基因组处于完全抑制的状态，DNA不能够进行复制和转录。这种状态下的染色质称为非活性染色质。在DNA的复制和转录过程中，染色质的结构受到暂时性的破坏，使得聚合酶等特异因子能够识别DNA序列中的结合位点，并阻止其装配成核小体，从而导致DNA的复制和转录。这种状态下的染色质称为活性染色质。,.,第二章染色体和DNA一.染色体,根据染色质的压缩程度的不同，在真核生物细胞分裂间期可以观察到两种不同类型的染色质：常染色质：压缩程度较低，其中的基因可以表达；异染色质：压缩程度高，其中的基因不表达。,.,第二章染色体和DNA一.染色体,染色体染色体是染色质包装压缩形成的一种高级的染色质结构。典型的真核细胞的直径约为1m，但却含有总长度达1-2m的DNA分子。它们必须被有序地包装，才能保证遗传信息的有效储藏与表达。,.,.,.,6.8:1,40:1,1000:1,8000:1,DNAdoublehelix,Nucleosome(10nmfiber),30nmFiber,LoopsI,LoopsII,chromosome,.,第二章染色体和DNA二.DNA的结构,二.DNA的结构1.DNA的一级结构:是DNA分子内碱基的排列顺序。在结构上，DNA是由单核苷酸通过3，5-磷酸二酯键连接而形成的高分子聚合物。从同一个磷酸基的3酯键到5酯键的方向定义为链的方向。DNA链的方向总是从5-P端到3-OH端(p.33)。DNA分子中的核糖的2位总是H(RNA中为OH)，所以DNA分子对碱的作用具有抗性，在pH11.5时，链的一级结构几乎没有变化，稳定性很强，不易断裂。而RNA很容易被碱水解。,.,第二章染色体和DNADNA结构-二级结构,2.DNA的二级结构:两条多核苷酸链反向平行盘绕所形成的双螺旋结构。DNA的二级结构分为两类:右手螺旋A-DNA和B-DNA构象A-DNA:当DNA处于转录状态时,DNA模板链与由它转录所形成的DNA-RNA双链。B-DNA:最常见的DNA双链构象,富含A和T碱基。左手螺旋Z-DNA构象，富含C和G碱基.与基因转录起始活性有关.,.,图:A-,B-,Z-型DNA三种结构比较p.34,.,第二章染色体和DNADNA结构-二级结构,Z-DNA调控基因转录的两种模式:,-ZDNA构象在转录区上游离转录区近时，抑制转录。-若离转录区远，可以增加转录区的负超螺旋程度促使转录。ZDNA构象有转录起始的调节活性。,.,Z-DNA的生物功能：,Zig-zag之字,与基因表达、基因调控有关。,.,第二章染色体和DNADNA结构-高级结构,3.DNA的高级结构:DNA双螺旋进一步扭曲盘绕所形成的特定空间结构.DNA高级结构的主要形式-超螺旋结构,正超螺旋,负超螺旋,负超螺旋,拓扑异构酶,溴乙锭,松驰DNA,正超螺旋,拓扑异构酶,溴乙锭,.,MOV:PBCA0267501supercoilingofDNA,.,第二章染色体和DNADNA结构-高级结构,图:环状DNA分子的链环数(L)、盘绕数(T)和扭曲数(W)之间的相互关系。L=T+W其中L为常量,T和W是变量。,.,第二章染色体和DNADNA结构-高级结构,超螺旋结构的形成是在拓扑异构酶的催化下进行链的切断-缝合反应。根据酶的作用机理可分为:拓扑异构酶I拓扑异构酶II,.,第二章染色体和DNADNA结构-高级结构,拓扑异构酶I共同特点:仅切断双链DNA中的一条链,随后进行连接；不需要能量辅助因子如ATP和NDP等,因而不能催化需能的超螺旋化结构的形成。I型酶一般是使高度超螺旋的DNA松弛。,.,第二章染色体和DNADNA结构-高级结构,拓扑异构酶I使双螺旋DNA减少一圈,超螺旋DNA放松,图:拓扑异构酶I的作用机理,.,第二章染色体和DNADNA结构-高级结构,E.coli的旋转酶(只有原核生物中有),图:E.coliDNA旋转酶导入负超螺旋的作用机理,细菌质粒DNA(环状双链DNA),.,第二章染色体和DNADNA结构-高级结构,拓扑异构酶II共同特点:双链DNA同时切断,随后进行连接；需要能量辅助因子如ATP和NDP等,催化需能的超螺旋化结构。,.,第二章染色体和DNADNA结构-高级结构,超螺旋结构的生物学意义:负超螺旋DNA在转录时起重要作用,在转录时,RNA聚合酶首先要与DNA特异性位点结合,DNA为负超螺旋对RNA聚合酶-DNA复合物形成速率、稳定性以及酶的转录活性都会大大提高。RNA聚合酶-DNA结合后，要解开12bp,而正超螺旋有利于链的解开。在转录时,DNA超螺旋形成和解旋是必不可少的,拓扑异构酶是转录过程必要的组分之一。,.,第二章染色体和DNADNA结构-高级结构,图:大肠杆菌的RNA转录过程图示,.,第二章染色体和DNA三.DNA的复制,DNA的半保留复制:子代的DNA双链中一条来自亲代(模板)，又一条是新合成的，这种复制方式被称为DNA的半保留复制。复制的起点、方向和速度复制点(Ori):是复制功能起始的特定位置。复制叉复制方向和速度:复制从Ori开始以双向等速复制方向进行的。复制的几种主要方式:线性DNA双链的复制先导链、滞后链、冈崎片段环状DNA双链的复制可分为:型大肠杆菌滚环型X174D-型线粒体,.,第二章染色体和DNA三.DNA的修复,1.DNA的错配修复(DNAmismatchrepair):在DNA复制时，错配修复系统修复复制酶没能检出的错配碱基，或者由于化学修饰产生的错配，从而保证了遗传物质复制的高保真，确保遗传的稳定性。,.,第二章染色体和DNA三.DNA的修复,目前，细菌的错配修复系统已经研究得比较透彻。在大肠杆菌错配修复系统中包含十多种蛋白：-错配矫正蛋白：MutS、MutL、MutH-单链结合蛋白(SSB)-DNA解旋酶II(DNAhelicaseII，UvrD，35解旋酶)-DNA聚合酶III全酶(DNApolymeraseIIIholoenzyme)-DNA连接酶(DNAligase)-核酸外切酶I(exonucleaseI)-核酸外切酶VII(exonucleaseVII)-核酸外切酶X(exonucleaseX)-RecJ,.,第二章染色体和DNA三.DNA的修复,启始修复过程可以分为步骤切除修复（p52）,.,根据母链甲基化原则进行错配修复过程示意图,启始：根据模板链上GATC中腺嘌（A）的甲基化原则错配校正蛋白MutS二聚体识别并结合错配位点；MutL蛋白在水解ATP的作用的调节下，与MutS结合,MutS-MutL在DNA双链上移动，发现离错配位点最近的甲基化碱基；发现甲基化碱基后，MutL-MutS-错配复合物激活MutH蛋白的内切酶活性，在对应于母链甲基化腺苷酸上游鸟苷酸的5位置切开非甲基化的子链。,Dam甲基化酶,.,甲基化指导的错配修复示意图,错配碱基位于切口3下游端,错配碱基位于切口5上游端，,切除：DNA解旋酶II从缺口向错配方向解开双链；由核酸外切酶将距离GATC到错配区域间的DNA链切除。为了防止剩下的暴露的单链遭到降解，需要有单链结合蛋白SSB）将其保护起来。修复：由DNA聚合酶全酶进行合成，连接酶对缺口进行连接。,【甲基定向错配修复(methyl-directedmismatchrepair,MMR)】,.,第二章染色体和DNA三.DNA的修复,MutS蛋白的应用：错配矫正蛋白MutS具有结合错配碱基的能力，MutS蛋白可以用于检测-突变-富集点突变-SNP（singlenucleotidepolymorphism，单核苷酸多态性）等方面SNP主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性.,.,第二章染色体和DNA三.DNA的修复,2.切除修复(excisionrepair):DNA切除修复有两种类型：碱基切除修复和核苷酸切除修复（1）碱基切除修复(baseexcisionrepair)研究发现，所有细菌中都带有不同类型、能识别受损核苷酸位点的糖苷水解酶。,.,第二章染色体和DNA三.DNA的修复,碱基切除修复系统糖苷水解酶AP核酸内切酶包括DNA聚合酶IDNA连接酶,.,糖甘水解酶识别受损碱基，把碱基从N-糖苷键处切下来，在DNA链上形成去嘌呤或去嘧啶位点，统称为AP位点（无嘌呤嘧啶位点）。,.,由AP核酸内切酶在AP位点附近（5或3位置）将受损核甘酸的糖甘-磷酸键切开,.,移去包括AP位点核苷酸在内的小片段DNA,（c）,移去包括AP位点核苷酸在内的一小段DNA,.,DNA连接酶连接,DNA聚合酶I将切除部位的核苷酸补齐,（d),（e）,.,第二章染色体和DNA三.DNA的修复,（2）核苷酸切除修复(Nucleotideexcisionrepair)当DNA链上相应位置的核苷酸发生损伤，导致双链之间无法形成氢键后，核苷酸切除修复系统将受损的核苷酸切除。核苷酸损伤发生后-先由DNA切割酶在己损伤的核苷酸5和3位分别切开磷酸糖苷键，产生一个由12-13个核苷酸（原核生物）或27-29个核苷酸（高等真核生物）组成的小片段，-解旋酶解旋，移去小片段-DNA聚合酶I（原核）或E（真核）合成新的片段，并由DNA连接酶完成修复。,.,DNA聚合酶E以母链为模板复制合成新子链,DNA连接酶将切口补平,大肠杆菌（左）和人类细胞（右）中的核苷酸切除修复过程示意图,受损伤的核苷酸,大肠杆菌DNA切割酶,人类DNA切割酶,DNA聚合酶I,.,第二章染色体和DNA三.DNA的修复,3.DNA的直接修复(DNAdirectrepair)DNA的直接修复不需要切除碱基或核苷酸，而是把损伤的碱基回复到原来状态的一种修复。例1：在光照或紫外线照射下形成的环丁烷胸腺嘧啶二体或6-4光化物，在DNA光解酶的作用下还原成为单体的过程。光或紫外线光激活酶(photoreactivatingenzyme)环丁烷胸腺嘧啶二体DNA光解酶胸腺嘧啶单体或6-4光化物,.,第二章染色体和DNA三.DNA的修复,例2：O6-甲基转移酶将O6-甲基鸟嘌呤恢复成鸟嘌呤。,.,在DNA光解酶(photolyase)的作用下将环丁烷胸腺嘧啶二体和6-4光化物还原成为单体,甲基转移酶使O6-甲基鸟嘌呤脱甲基生成鸟嘌呤，防止G-T配对O6-methylguanineDNAmethyltransferaes,紫外线诱发形成嘧啶二体,O6-甲基转移酶将O6-甲基鸟嘌呤恢复成鸟嘌呤,.,第二章染色体和DNA四.DNA的重组,DNA的重组(DNArecombination)一个生物个体基因组获得了外来DNA片段，称为DNA重组。人为的DNA重组属于基因工程范筹.根据重组中对DNA序列和所需蛋白质因子的要求把重组分为四类：同源性重组、位点特异性重组、转座重组和异常重组。,.,第二章染色体和DNADNA的同源重组,DNA的同源重组(Homologousrecombination)同源性重组是指发生在同源DNA序列相同区域之间的重组。同源染色体上相同区域之间的重组。,.,第二章染色体和DNADNA的同源重组,同源性重组的基本条件交换区具有相同或相似的序列DNA分子中不同部位间的重组有时也会发生,这种重组称为异位重组。异位重组会导致DNA序列的缺失、复制、倒位等现象。,.,第二章染色体和DNADNA的同源重组,双链DNA分子之间互补碱基进行配对两个DNA分子的链之间互补的碱基配对能确保重组只发生在同样的基因座之间,也就是DNA分子的相同的部位。两个双链DNA分子通过链之间互补的碱基配对被维系在一起称为联会.同源性重组涉及到联会的形成。,.,第二章染色体和DNADNA的同源重组,重组酶同源性重组:两条DNA双螺旋分子间断裂修复连接重组体的释放异源双链区的形成同源性重组时,在两个DNA分子之间互补碱基配对的区域称为异源双链区。,.,第二章染色体和DNADNA的同源重组,Holliday双链侵入模型同源重组过程涉及两个DNA分子间同源区域的交换。在大肠杆菌中，当二个同源DNA双螺旋排列在一起时，-在一对姐妹染色单体上产生切口,-含有5端切口的单链DNA形成RecA-ssDNA细丝,-这些细丝相互交换并寻找相对的DNA双螺旋上的相应序列(侵入),-切口被封好并形成四分支的Holliday结构(这个结构是动态的),-交叉点左右任何两个方面移动相当一段距离(分支迁移)，这个Holliday中间体能以两种方式中的一种拆分为两个DNA双螺旋。,.,分支迁移,Holliday中间体,.,.,第二章染色体和DNADNA的同源重组,.,第二章染色体和DNADNA的同源重组,.,第二章染色体和DNADNA的同源重组,RecBCD核酸酶从一端靠近Chi位点，在移动中降解DNA。在Chi位点它行使内切酶活性切断单链，然后丢掉RecD，只保留解旋酶活性。,只要在入侵单链和双链之间有自由的末端，RecA蛋白就能促进单链的同化。,.,第二章染色体和DNADNA的同源重组,Ti质粒,TDNA整合进植物基因组后，TDNA上的基因负责编码细胞分裂素的产生、吲哚乙酸的产生合成和释放新的植物代谢产物根癌碱和农杆碱,.,第二章染色体和DNADNA的同源重组,根癌农杆菌中的Ti（tumor-inducing）质粒,根癌菌附着在植物细胞表面,.,第二章染色体和DNADNA的位点特异性重组,2.位点特异性重组(Site-specificrecombination)位点特异性重组是指发生在特殊序列之间的重组。当噬菌体侵入大肠杆菌后,-DNA有两种存在型式:裂解状态-DNA在被感染的细菌中以独立的环状分子结构存在。溶源状态噬菌体DNA则是细菌染色体的一部分(称为原噬菌体,prophage)。整合转换:裂解状态溶源状态切除,.,第二章染色体和DNADNA的位点特异性重组,噬菌体的类型裂解状态裂解类型的噬菌体在感染寄主细胞后将寄主细胞转变为噬菌体的“制造厂”,生产出大量的子代噬菌体颗粒。这种噬菌体被称之为烈性噬菌体。溶源状态溶源类型的噬菌体在感染寄主细胞的过程中没有子代噬菌体颗粒的产生,只是噬菌体的DNA被整合到寄主细胞染色体中,成为它的一个组成部分。这种噬菌体被称之为温和噬菌体。,.,.,第二章染色体和DNADNA的位点特异性重组,子代噬菌体,烈性噬菌体,温和噬菌体,噬菌体,大肠杆菌细胞,噬菌体DNA整合到宿主染色体DNA中,图:噬菌体溶菌和溶源的繁殖方法,.,第二章染色体和DNADNA的位点特异性重组,(1)噬菌体DNA的整合与切除机制噬菌体在溶源状态,游离的-DNA必须整合到细菌DNA中去;为了从溶源状态向裂解状态转化,原噬菌体DNA则必须从细胞染色体DNA上切除。整合和切除都是通过细菌DNA和DNA上特定序列之间的重组而实现。这些特定序列被称为附着点(attachmentsite,att)。,.,第二章染色体和DNADNA的位点特异性重组,为了描述整合切除反应,细菌的附着点(att)特异的序列为attB,含有B、O和B三个序列(BOB);噬菌体的附着点特异的序列为attP,由P、O和P三个序列组成(POP),*其中O序列是attB和attP所共有的,序列完全一致,称为核心序列。(coresequence),长15bp,是位点特异性重组发生的地方。两侧的B,B和P,P称为臂,其序列各不相同。,.,GCTTTTTTATACTAACGAAAAAATATGATT,噬菌体DNA,GCTTTTTTATACTAACGAAAAAATATGATT,大肠杆菌DNA,p,P,B,B,O,O,.,第二章染色体和DNADNA的位点特异性重组,噬菌体DNA的整合机制:噬菌体DNA整合到Ecoli基因组DNA时，-先由噬菌体基因所表达的产物整合酶（Int）同时在噬菌体和E.coli的核心序列上交错切割,使附着点序列上形成具7个碱基突出的粘性末端。-在细菌编码的整合宿主因子(IHF)的参与下使-DNA整合到宿主基因组DNA中。,.,GCTTTTTTATACTAACGAAAAAATATGATT,噬菌体DNA,GCTTTTTTATACTAACGAAAAAATATGATT,大肠杆菌DNA,p,P,B,B,O,O,.,TTTATACTAAGCTTTATTCGAAAAAATATG,噬菌体DNA,TTTATACTAAGCTTTATTCGAAAAAATATG,大肠杆菌DNA,p,P,B,B,O,O,.,.,第二章染色体和DNADNA的位点特异性重组,整合反应:噬菌体DNA+细菌DNA=原噬菌体需要Int和IHF的参与Int(integrase):产物整合酶-是由噬菌体的int基因所编码,-它只能催化BOB和POP之间的重组,对POP序列有强的亲和性,-当整合酶存在时,整合反应是不可逆的。IHF(integrationhostfactor):整合宿主因子-是由细菌编码的一种细菌蛋白。,.,第二章染色体和DNADNA的位点特异性重组,噬菌体DNA的切除机制:噬菌体DNA从细菌整合体中释放出来。,.,第二章染色体和DNADNA的位点特异性重组,噬菌体DNA的整合和切除噬菌体细菌原噬菌体POP(attP)+BOB(attB)BOP(attL)+POB(attR),整合Int,IHF,Int,IHF,Xis切除,.,第二章染色体和DNADNA的位点特异性重组,切除反应:,催化切除反应除了Int和IHF蛋白外,还需要切除酶(exicisionase,Xis)的参与,该酶由噬菌体的xis基因编码。Xis对控制反应方向起重要作用,它是切除反应所需要的,但却抑制整合反应。Xis和Int结合形成复合体,具有与BOP和POB结合的能力,促进两者之间相互作用和重组,但不能催化BOB和POP之间的重组。在Xis大量存在时,切除作用是不可逆的。,.,整合和切离反应作用位点是不同的，整合需要识别attP和attB;而切离时需要attL和attR。位点特异重组是通过重组位点的鉴别来控制的，因此这两个反应所依赖的蛋白质也不相同。,.,IHF结合attp中约20bp的序列，结合位点和int的结合位点邻近。Xis有两个结合位点，在attP中互相靠近，保护区域超过30-40bp.xis的结合可改变DNA的结构，使其成为整合反应的惰性底物，而促使反应向切离反向进行。,.,第二章染色体和DNADNA转座重组,3.DNA转座重组(transpositionalrecombination),DNA转座（移位）：由可移位因子介导的遗传物质重新排列现象。,1951年由BarbaraMclintock（麦克林托克）首次在玉米中发现了一种控制元件，后来这个元件被命名为转座元件或转座子。由此，BarbaraMclintock在1983年获得了诺贝尔奖。,.,第二章染色体和DNADNA转座重组,特点：不必借助同源序列就可移动的DNA片段，即转座作用与供体和受体之间的序列无关。转座序列可沿染色体移动，也可在不同染色体间跳跃（又称之为跳跃基因）。原核生物和真核生物均有转座子。,.,第二章染色体和DNADNA转座重组,1)原核生物转座子的分类与结构特征根据转座子结构的不同，可以分为两大类型：插入序列（IS因子）分类带有IS序列复合型转座子不带有IS序列,.,第二章染色体和DNADNA转座重组,(插入序列又称为IS因子(insertionalsequence)最简单的转座子.P.56表2-13特点:-是细菌染色体或质粒DNA的正常组分,除了携带自身转位作用的基因(转位酶)之外,不含任何宿主基因.-未端具有倒置重复序列,编码转位酶的基因序列位于两倒置重复序列之间，转座时往往复制宿主靶位点一小段(4-15bp)DNA序列,形成位于IS序列两端的正向重复区。-IS序列只有一个开放阅读框架,翻泽起始位点紧挨着第一个倒置重复区,终止点位于第二个倒置重复区或重复区附近。,.,转位酶基因,.,第二章染色体和DNADNA转座重组,读码框架：任何一段编码蛋白质的核苷酸序列都会有三种可能的方式将核苷酸翻译成蛋白质,这三种可能的读码(readingframe)方式称为读码框架。开放阅读框架/可译框架/可读框(openreadingframe,ORF)是指一段连续的核苷酸序列能够被翻译成为完整多肽链的DNA序列。它是由起始密码子开始，到终止密码子结束。封闭阅读框（blockreadingframe）阅读框因终止密码出现频繁故不能合成完整蛋白的DNA序列。,.,第二章染色体和DNADNA转座重组,A,U,C,G,图:基因的三个阅读框,.,第二章染色体和DNADNA转座重组,图:基因的开放阅读框,.,第二章染色体和DNADNA转座重组,命名：IS编号（鉴定类型）长度7002000bp,.,第二章染色体和DNADNA转座重组,区域优先,P.57,.,第