第六章--蛋白质定量和定性分析

第六章蛋白质定量和定性分析(Qualitativeandquantitativeanalysisofprotein),第一节蛋白质含量测定第二节蛋白质分子量的测定第三节蛋白质纯度分析第四节糖蛋白中糖含量分析第五节蛋白质序列分析第六节生物质谱技术与蛋白质鉴定,本章内容,第一节蛋白质含量测定,微量凯氏定氮法Folin-酚试剂法紫外光吸收法考马斯亮蓝法,目前常用的有四种古老的经典方法:定氮法,双缩脲法(Biuret法)，Folin-酚试剂法(Lowry法)和紫外吸收法.另外还有一种近十年才普遍使用起来的新测定方法,考马斯亮蓝法(Bradford法)。其中Bradford法和Lowry法灵敏度高，比紫外吸收法高10-20倍，比Biuret法高100倍以上。凯氏定氮法比较复杂，但较准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。,一、微量凯氏定氮法,蛋白质的主要组成元素C,H,O,N,S，各种蛋白质中含氮量恒定在13%-19%，平均为16%。每100克蛋白质中含氮约为16克。而且生物组织中的氮主要存在于蛋白质中，因此测定生物组织中的氮含量可计算出蛋白质含量。,蛋白质含量=含氮量6.25,蛋白质是含氮的有机化合物。食品与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数计算出蛋白质含量。,一、原理,1.有机物中的氮在强热和CuSO4、浓H2SO4作用下，消化生成(NH4)2SO4,含氮有机物+H2SO4(NH4)SO4+CO2+H2O+,2.在凯氏定氮器中与碱作用，通过蒸馏释放出NH3，收集于H3BO3溶液中。,(NH4)SO4+NaOHNa2SO4+2NH3H2ONH3H2O-蒸馏NH3+H2ONH3+H3BO3(NH4)3BO3,（二）实验原理,3.再用已知浓度的HCl标准溶液滴定，根据HCl消耗的量计算出氮的含量，然后乘以相应的换算因子，既得蛋白质的含量。,(NH4)3BO3+3HCl3NH4Cl+H3BO3,实验试剂与仪器,实验试剂浓硫酸硫酸钾（提高沸点）沸点由330提高到400加速了消化过程。硫酸铜（催化剂）NaOH溶液(30%)硼酸溶液(2%)盐酸标准溶液（0.01mol/L）指示剂:溶于95%乙醇的0.1%溴甲酚绿溶液10ml和溶于95%乙醇的0.1%甲基红2ml混合而成。,凯氏定氮装置,自动凯氏定氮仪,(三)、实验步骤,一、消化称取样品0.51g，置于凯氏烧瓶内，不使沾染瓶颈.加入1gK2SO4,0.5gCuSO4及6ml浓H2SO4，在通风橱内的消化炉上加热，先用小火,待水分蒸发完后,可用较大的火焰.消化到瓶内溶液呈透明的蓝绿色为止,但要瓶内无黑点,有则需要瓶内溶液把它冲洗下去,再加热至澄清为止.冷却，转入100ml容量瓶中，以少许蒸馏水冲洗烧瓶数次，洗液并入容量瓶中，加水至刻度，摇匀。,二蒸馏器清洗图中所示的蒸馏器使用方法如下:开放自来水龙头,使水从E进入G,从K流出,(水不宜开得过大以免水从G溢出).开放P3使水进入A,从漏斗D中加蒸馏水约10ml入B,用拇指将G管口掀紧.同时开放P1则B中水从Y型管中冲出.随后A中水经K流出.一般情况下,如此重复洗涤两次即可.若蒸馏器内有氨存在,则应加入5ml蒸馏水和30%NaOH溶液2ml后蒸馏一次方可使用.,A为蒸气发生器,P3为其进水开关,B为蒸馏室,与出气管M相通,H为装有定量酸液的锥形瓶,B有Y型管,一端与A相通,另一端经P4与漏斗D相连,可经此将样品及试剂加入B,F为指形冷凝管,E为进入管,水经F,G,K而流出,蒸馏时B装进消化好的样品及NaOH,二者反应生产氨,A因加热而产生的水蒸气经Y管进入B,将氨一起带出,经M管进入锥形瓶中被酸吸收,蒸汽经冷凝管F周围被冷却,便于被酸液吸收,三氨的吸收1、蒸馏器洗净后,从G加入小瓷片数粒,开放水龙头和P3使瓷片随水流入A,水放至A球颈处即可.2、取150ml锥形瓶,加入2%硼酸20ml(内加23滴混合指示剂),将锥形瓶置于M下并使管口接触至硼酸溶液底层.3、准确吸取稀释消化液5ml,由漏斗D注入蒸馏器,少量蒸馏水冲洗漏斗,加入30%NaOH约5ml,再用少量蒸馏水冲洗,夹紧螺旋夹并水封,使氨气不会从漏斗处流失.4、用电炉加热,待第一滴蒸馏液从冷凝柱F顶端滴下时起计时,继续蒸馏5min,然后将锥形瓶放低,使M管离开液面再蒸馏2min,最后用蒸馏水洗导管外壁.取出锥形瓶,随即将蒸馏器洗净,四、滴定,用0.01mol/LHCl滴定锥形瓶内溶液至淡紫色或灰色为止,记录滴定所用HCl的量,五、蛋白质含量的计算试样中蛋白质的含量=(V1-V2)HClmol/L0.014206.25100%/WV1:滴定试样时用去的HCl的ml数V2:滴定空白时用去的HCl的ml数mol/L:HCl的摩尔浓度W:试样的重量0.014:氮的毫摩尔6.25:氮换算成蛋白质的系数20:稀释倍数,(四)、注意事项,a.样品应是均匀的，若是固体样品应事先研细，液体样要混合均匀。b.样品放入凯氏烧瓶时，不要黏附瓶颈上，以免被检样消化不完全，使结果偏低。c.样品中若含脂肪或糖较多,消化过程中易产生大量泡沫,为防止泡沫溢出瓶外,在开始消化时应用小火加热,并时时摇动。d.当样品消化液不易澄清透明时,可将凯氏烧瓶冷却,加入30%过氧化氢2-3mL后再继续加热消化.,e.一般消化至透明后,继续消化30min即可,但对于含有特别难以消化的氮化合物的样品,如赖氨酸、组氨酸、色氨酸等时,需适当延长消化时间.有机物如分解完全,消化液呈蓝色或浅绿色,但含铁量多时,呈较深绿色.f.硼酸吸收液的温度不应超过40,否则对氨的吸收作用减弱而造成损失.g.蒸馏完毕后,应先将冷凝管下端提离液面,再蒸2min后关掉热源,否则可能造成吸收液倒吸。,二、Folin-酚试剂法,一、原理,蛋白质分子的肽键结构在碱性环境中能与Cu2+络合成紫色络合物（双缩脲反应），但络合物颜色浅，吸光度不易测出，故灵敏度低。由于形成络合物后，蛋白质的肽链展开，使其中的酪氨酸等残基充分暴露，而蛋白质中酪氨酸的酚基在碱性条件下与酚试剂（磷钨酸-磷钼酸化合物）反应，使高价的Mo6+和W6+还原生成低价的钼离子和钨离子，呈铜蓝及钨蓝的颜色，蓝色的深浅与蛋白质含量成正比。在一定范围内符合L-B定律（20-300g/mL）,一、实验原理,Folin-酚试剂由甲试剂与乙试剂组成。甲试剂由碳酸钠、氢氧化钠、硫酸铜及酒石酸钾钠组成。蛋白质中的肽键在碱性条件下，与酒石酸钾钠铜盐溶液起作用，生成紫红色络合物。,乙试剂是由磷钼酸和磷钨酸、硫酸、溴等组成。此试剂在碱性条件下，易被蛋白质中酪氨酸的酚基还原，呈蓝色反应(钼蓝和钨蓝混合物)，其色泽深浅与蛋白质含量成正比。,Folin-酚法优点是操作简单，迅速，不需特殊仪器设备，灵敏度高，较紫外吸收法灵敏10-20倍，较双缩脲法灵敏100倍。可测定范围20250ug蛋白质。反应约在15min内有最大显色，并至少可稳定几小时。此法也适用于测定Tyr,Trp含量。其不足之处是此反应受多种因素干扰。,二.实验用品,1.材料：待测样品,使用前稀释至合适的倍数2.试剂标准牛血清(或酪蛋白)溶液:称取125毫克蛋白粉末，用0.1N氢氧化钠溶液润湿，溶解，加蒸馏水到250毫升，则配成500微克/毫升的标准蛋白溶液。Folin-酚试剂甲:Folin-酚试剂乙:3.仪器设备,三.方法和步骤,1.标准曲线的制作:将6支干净试管编号，按下表进行操作,表1.酪蛋白标准曲线的制作,2.样品中蛋白的测定取2支试管，分别加入0.2毫升样品(待测)稀释液，再加入0.8毫升蒸馏水使样品体积达到1毫升。将样品的光吸收值在标准曲线上查出相应的标准蛋白溶液的浓度。然后乘以稀释倍数，得出未稀释样品含蛋白质的克数。,四.实验结果,计算：总蛋白含量=(蛋白含量/0.2ml)总体积,注意：蛋白质中酪氨酸含量不同，生色强度不同，所以使用同种蛋白质（同源Pr)作标准，灵敏度比双缩脲反应高100倍,三、紫外光吸收法,一、原理,由于含有酪氨酸和色氨酸，大多数Pr在280nm处有一明显吸收峰，可利用此快速灵敏地测定Pr浓度。由于Pr样品中经常杂有核酸，对280nm光波也有吸收，但不如260nm光波吸收强，可通过统计计算，排除测定Pr含量时核酸的干扰。,三、计算CP(mg/mL)=F1/dA280F-校正因子orCP(mg/mL)=1.45A2800.74A260(经验公式）四、优点及缺点优点：灵敏度高，20-100g/mL方法简单盐类干扰少蛋白质不需处理，可回收,缺点：对于测定与标准蛋白质中酪氨酸、色氨酸含量差异较大的蛋白质有一定误差，故适于测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。,四、考马斯亮蓝法,考马斯亮蓝G-250（CoomassiebrilliantblueG-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。,一、原理,蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h内保持稳定。该法是1976年Bradford建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为01000gmL，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。,（1）牛血清白蛋白标准溶液的配制：准确称取100mg牛血清白蛋白，溶于100mL蒸馏水中，即为1000gmL的原液。（2）蛋白试剂考马斯亮蓝G-250的配制：称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50mL90乙醇中，加入85（WV）的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1000mL。此溶液在常温下可放置一个月。（3）乙醇（4）磷酸（85）,二、试剂,三、操作步骤,1标准曲线制作（1）0100gmL标准曲线的制作：取6支10mL干净的具塞试管，按表1取样。盖塞后，将各试管中溶液纵向倒转混合，放置2min后用1cm光经的比色杯在595nm波长下比色，记录各管测定的光密度OD595nm，并做标准曲线。,表1低浓度标准曲线制作,四、结果计算,式中：X为在标准曲线上查得的蛋白质含量（g）。,Bradford法的突出特点:(1)灵敏度高.其最低检测蛋白质含量可达1mg,这是因为蛋白质与染料相结合后产生的颜色变化很大,蛋白质-染料复合物有更高的吸光系数,因而光吸收要比Folin酚试剂法大得多.(2)测定快速,简洁,只需要加一种试剂.完成一个样品的测定,只要5分钟左右.由于染料与蛋白质结合的过程,大约只要2分钟即可完成,其颜色可以在1小时内保持稳定,且在5分钟至20分钟之间,颜色的稳定性最好.(3).干扰物质少.,五、注意事项,Bradford法由于染色方法简单迅速，干扰物质少，灵敏度高，现已广泛应用于蛋白质含量的测定。有些阳离子，如K+、Na+、Mg2+、(NH4)2SO4、乙醇等物质不干扰测定，但大量的去污剂如TritonX-100、SDS等严重干扰测定。3蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合的反应十分迅速，在2min左右反应达到平衡；其结合物在室温下1h内保持稳定。因此测定时，不可放置太长时间，否则将使测定结果偏低。,一、蛋白质含量的测定,1)凯氏定氮法：灵敏度较低2)双缩脲法：样品量0.2-1.7mg/L3)Folin-Lowry法：在碱性条件下磷钼酸、磷钨酸混合试剂与酪氨酸上的酚发生反应，生成蓝色化合物，将其与双羧脲法结合起来，蛋白质形成两种颜色的混合物呈绿色，在650nm具有特定的吸收。灵敏度较高25g-250g/ml。BCA法,1、蛋白质总量的测量,4)考马斯亮蓝法（Bradford法）考马斯亮蓝G250是一种带有负电荷的染料，在酸性条件下，可与蛋白质上的正电荷结合，形成蓝色化合物，在595nm具有特定吸收，反应简便、快速、灵敏度高，5-50g/ml。,5)紫外吸收法由于核酸在260nm具有光吸收，对测定干扰较大，可采用280nm、260nm同测法。蛋白质浓度mg/ml1.45A280-0.74A260,蛋白质的定量法比较,克氏(Kjeldahl)定氮法:经典的标准方法，现已不多用。双缩脲(biuret)法:常用于需要快速但并不需要十分精确的测定。Folin-酚（Lowry）法:蛋白质标准测定方法。紫外法:虽然精确度不高，但操作简单，样品可以回收。Bradford法:灵敏度高，能检测一个微克的蛋白，重复性好。BCA(bicinchoninicacid)法:FDA唯一认可,蛋白质的定量法,原理图：,BCA分子式：,第二节蛋白质分子量的测定,根据化学组成测定最低分子量利用凝胶过滤法测定分子量公式：VeVo=ablogMlogM=K1K2Ve利用SDSPAGE法测定分子量公式：logM=K1K2R4.质谱法5.通过渗透压测定蛋白质分子量,蛋白质通过凝胶柱的速度即洗脱体积与其分子量有关,（Ve为洗脱体积）,logM=k1-k2Ve,先测得几种标准蛋白质的Ve，并以其分子量对数对Ve作图得一直线，再测出待测样品的Ve，查标准曲线即可确定分子量。,第三节蛋白质纯度分析,微量凯氏定氮法Folin-酚试剂法紫外光吸收法考马斯亮蓝法,蛋白质纯度鉴定通常采用物理化学的方法：电泳、沉降、HPLC和溶解度分析等。目前采用的电泳分析有等电聚集、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）和SDS-PAGE、毛细管电泳等。纯的蛋白质在一系列不同的pH条件下进行电泳时，都将以单一的速度移动，它的电泳图谱只呈现一个条带（或峰）同样地，纯的蛋白质在离心场中，应以单一的沉降速度移动。由于沉降系数主要是由分子大小和形状决定的，而与化学组成无关，因此作为鉴定纯度的方法，它要比电泳分析差些。HPLG常用于多肽、蛋白质纯度的鉴定。,第三节蛋白质纯度分析,蛋白质的纯度鉴定,基本手段：电泳分析：单条带。N端测定：n亚基蛋白有1-n个N端aa。选用手段：沉降分析：纯的蛋白质在离心场中以单一的沉降速度移动。溶解度分析：结晶分析（能结晶的一般比较纯，具有活性）,纯的蛋白质在一定的溶剂系统中具有恒定的溶解度，而不依赖于存在于溶液中未溶解固体的数量。如果蛋白质制品是纯的，那么溶解度曲线只呈现一个折点；不纯的蛋白质的溶解曲线常常呈现2个或2个以上的折点。,蛋白质的溶解度分析,蛋白质的纯度鉴定,其它鉴定工作（略）：1、分子量的测定2、等电点测定3、N-末端AA测定4、C-末端AA的测定（肼解法）5、光吸收：全波长扫描。找出它的吸收峰位置和最大吸则。6、AA组分分析,糖类,单糖,多糖,糖复合物(glycoconjugates),糖蛋白(glycoprotein),蛋白聚糖(proteoglycan),糖脂(glycolipids),第四节糖蛋白中糖含量分析,一种或多种糖以共价键连接到肽链上的蛋白质。,蛋白质含量较多，糖所占比例变动大，表现为蛋白质的特性。,分布细胞膜、溶酶体、细胞外液,糖蛋白,葡萄糖(Glu)半乳糖(Gal)甘露糖(Man)N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)岩藻糖(Fuc)N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)N-乙酰神经氨酸(NeuAc),（一）糖蛋白聚糖分为N-连接和O-连接型两种,一、糖蛋白糖链的结构,聚糖中单糖的种类：,糖蛋白糖链的N-连接型和O-连接型,连接方式,（二）N-连接糖蛋白的糖基化位点为Asn-X-Ser/Thr,糖蛋白的糖链与蛋白部分的Asn-X-Ser序列的天氡酰胺氮以共价键连接称N-连接糖蛋白。,定义：,N-连接糖蛋白中Asn-X-Ser/Thr三个氨基酸残基的序列子称为糖基化位点。,糖蛋白分子中聚糖结构的不均一性称为糖型(glycoform)。,（三）N-连接聚糖可分为3型,（四）N-连接寡糖的合成是以长萜醇作为聚糖载体,N-连接寡糖是在内质网上以长萜醇作为糖链载体，先合成含14糖基的寡糖链，然后转移至肽链的糖基化位点上，进一步在内质网和高尔基体进行加工而成。每一步加工都由特异的糖基转移酶或糖苷酶催化完成，糖基必须活化为UDP或UDP的衍生物。,长萜醇-P-P聚糖的合成,3型N-聚糖的加工过程,（五）O-连接糖蛋白,糖蛋白糖链与蛋白部分的丝/苏氨酸残基的羟基相连，称为O-连接糖蛋白。,O-连接寡糖有N-乙酰半乳糖与半乳糖构成核心二糖，核心二糖可重复延长及分支，再接上岩藻糖、N-乙酰葡萄糖胺等单糖。,定义,O-连接寡糖结构,O-连接寡糖在N-乙酰半乳糖基转移酶的作用下，在多肽链的丝/苏氨酸的羟基上连接上N-乙酰半乳基，然后逐个加上糖基直至O-连接寡糖链的形成。,O-连接寡糖合成,（六）蛋白质-N-乙酰氨基葡萄糖基化是可逆的单糖基修饰,-N-乙酰氨基葡萄糖(-N-acetylglucosamine，O-GlcNAc)糖基化修饰，主要发生于膜蛋白和分泌蛋白。,O-GlcNAc糖基化修饰是通过O-GlcNAc糖基转移酶(O-GlcNActransferase,OGT)作用，将-N-乙酰氨基葡萄糖以共价键方式结合于蛋白质的Ser/Thr残基上。,O-GlcNAc糖基化蛋白质的解离需要特异性的-N-乙酰氨基葡萄糖酶(O-GlcNAcase)作用，O-GlcNAc糖基化与去糖基化是个动态可逆的过程。,O-GlcNAc糖基化位点常位于蛋白质Ser/Thr磷酸化位点处或其邻近部位。糖基化后即会影响磷酸化的进行，反之亦然。,（七）糖组学,糖组学则包括聚糖种类、结构鉴定、糖基化位点分析、蛋白质糖基化的机制和功能等研究。,糖组(Glycome)是指一种细胞或一个生物体中全部聚糖种类。,二、糖蛋白分子中聚糖的功能,保护糖蛋白不受蛋白酶的水解，延长其半衰期；蛋白质的聚糖也可起屏障作用，影响糖蛋白的作用；聚糖还可以避免蛋白质中抗原决定簇被免疫系统识别而产生抗体。,（一）聚糖可影响糖蛋白生物活性,（二）糖蛋白聚糖加工可参与新生肽链折叠,参与新生肽链的折叠并维持蛋白质的正确的空间构象；糖蛋白的糖基化与肽链的折叠及分拣密切相关。,（三）糖蛋白聚糖可参与维系亚基聚合,具有功能的糖蛋白的二聚体，往往依靠糖-蛋白或糖-糖相互作用维系亚基的聚合和构象。,（四）聚糖对蛋白质在细胞内的分拣、投送和分泌中的作用,有些蛋白质的投送信号存在于肽链内，但有些是与其糖链有关。,（五）糖蛋白聚糖具有分子间的识别作用,聚糖中单糖分子连接的多样性是聚糖起到分子识别作用的基础。受体与配体识别和结合也需聚糖的参与。细胞表面糖复合物的聚糖还能介导细胞-细胞的结合。,生物质谱技术与蛋白质鉴定,第一节基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱第二节液相色谱电喷雾串联质谱第三节肽质量指纹谱鉴定蛋白质技术第四节串联质谱数据鉴定蛋白质技术,质谱分析法是通过测定样品离子的质荷比(m/z)来进行成分和结构分析方法。自1886年Goldstein发明早期质谱仪器常用的离子源，到1942年第一台单聚焦质谱仪商业化，质谱基本上处于理论发展阶段。随后质谱在电离技术和分析技术上的发展和完善，使之很快应用于地质、空间研究、环境化学、有机化学、制药等多个领域。,质谱技术真正意义上的变革是80年代中期出现的两种新的电离技术：电喷雾电离和基质辅助激光解吸电离，这两种技术所具有的高灵敏度和高质量检测范围，使得检测相对分子质量高达几十万道尔顿的生物大分子成为可能，从而开拓了质谱学的一个崭新的领域生物质谱，促使质谱技术在生命科学领域获得广泛的应用和发展。随着人类基因组全序列的问世，以大规模分析细胞或生物体内的蛋白质为主的蛋白质组研究成为后基因组时代的重要研究内容。蛋白质组研究所必需的高灵敏度，高鉴定速度使得传统的生物化学方法远远不能满足要求，而生物质谱技术的发展，为蛋白质组研究提供了关键的技术手段，成为蛋白质组研究的三大关键技术之一。,第一节基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱,一、MALDI离子源MALDI(matrix-assistedlaserdesorptionionization)的电离的方式于1988年由Karas和Hillenkamp提出。MALDI的基本原理是将分析物分散在基质分子(尼古丁酸及其同系物)中并形成晶体，当用激光(337nm氮激光)照射晶体时，基质分子吸收激光能量，样品解吸附，基质-样品之间发生电荷转移使样品分子电离。,MALDI-TOF,MALDI:MatrixAssistedLaserDesorptionIonization,基质的使用是这一电离技术的关键，基质吸收了激光的大部分能量并气化，同时将样品分子带入气相，样品分子只吸收少量激光能量，避免了分子化学键的断裂。基质在样品离子形成过程中充当了质子化或去质子化试剂，使样品分子带上正电荷或负电荷。常用的基质是一些小分子有机酸及其衍生物，能够很好地吸收激光能量（见表6-1）,MALDI源使用的激光是脉冲式，每一脉冲激光产生的一批离子得到一张质谱图，一般使用的质谱图是多次脉冲激光扫描质谱峰结果的累加。MALDI源产生的离子多为单电荷离子，质谱图中的谱峰与样品各组分的质量数有一一对应关系，因此MALDI-MS最适合分析多肽及蛋白质混合物。MALDI源的离子化效率非常高，所以这种仪器是现今灵敏度最高的质谱仪，能够对极微量样品进行分析。,二、线形飞行时间质量检测器MALDI-MS通常用飞行时间(timeofflight,TOF)检测器作为质量分析器，所构成的仪器称为基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)。飞行时间检测器的质量分析范围很大，从几百道尔顿到100kDa都可以检测。,离子源中每一脉冲激光产生的离子先经过一个加速电场，获得动能，再进入一个高真空电场飞行管道，离子在此无电场飞行管道内以在加速电场获得的速度飞行。质量较轻的离子飞行速度快，较早达到检测器，较重的离子则较晚达到检测器，离子的飞行时间与其质荷比的平方根(m/z)1/2成正比。通过检测飞行时间来测定离子的质荷比(图6-1)。由和推出其中E为离子在加速电场获得的动能，U为加速电场电压，z为离子所带电荷，m为离子质量，v为离子飞行速度，L为飞行管道长度，t为离子飞行时间，const为一常数。,MALDI/Time-of-Flight,N2Laser,Detector,Source,-V,+,+,+,+,DriftTube,-V,+,+,+,+,三、反射飞行时间质量检测器,线性飞行管的MALDI-TOF-MS的质量分辨率和测量准确度不高，测量误差在2左右，不能满足蛋白质鉴定的需求。为了改进仪器的分辨率和质量测量准确度，在仪器的飞行管道内加了一个反射电场，称为ionmirror或reflector，构成的仪器成为反射飞行时间质谱(RETOT-MS)(图6-2，6-3)。反射电场起了能量聚焦作用，即具有相同质荷比但能量有细微差异的离子在反射电场作用下飞行时间达到一致，同时离子改变了飞行方向，延长了飞行距离，所以反射飞行时间质谱的分辨率和质量测量准确度都有了很大的提高。为了使离子能够转向并飞到反射检测器，反射电场的电压要大于加速电场电压。反射检测方式只能分析质量数10kDa以下的离子。,具有反射飞行时间分析器的MALDI-TOF-MS可以分析源后衰变(post-sourcedecay,PSD)产生的亚稳离子，这是一种串联质谱分析，可获得离子结构信息。PSD产生的离子(母离子)在飞行管道飞行过程中发生裂解，丢失部分中性碎片，剩余的离子片断(子离子)成为质量减少，飞行速度不变，即动能减少的亚稳离子。母离子与子离子在反射电场中的通过时间不同，为了分析子离子，实际操作中，通过逐步减小反射电场电压的方式检测子离子。PSD谱图通常是由10到20个不同反射电压下的谱图叠加而成。为了覆盖质量在母离子质量的10%-100%范围内的子离子，反射电场电压要下降到原反射电压的10%。,四、样品制备方法,要获得一张满意的质谱图，样品制备十分关键。对蛋白质和多肽类样品，通常采用的样品制备方法如下：基质a-氰基-4-羟基肉桂酸用0.1%三氟乙酸，30%-50%乙腈溶液配成饱和溶液，稀释1到3倍可以减少基质加和峰，要求每天新鲜配制。样品溶于0.1%三氟乙酸溶液。基质与样品以1:1体积混合，取0.5-1mL加到不锈钢样品靶上，在空气中放置几分钟，将溶剂挥发干后将样品靶送入仪器。,图6-4是由MALDI-MS分析得到乙醇脱氢酶的胰蛋白酶酶切肽图：,第二节液相色谱电喷雾串联质谱,一、电喷雾电离源电喷雾电离方法是利用高电场使质谱进样端的毛细管柱流出的液滴带电，在N2气流的作用下，液滴溶剂蒸发，表面积缩小，表面电荷密度不断增加，直至产生的库仑斥力与液滴表面张力达到雷利极限，液滴爆裂为带点的子液滴，这一过程不断重复使最终的液滴非常细小呈喷雾状，这时液滴表面的电场非常强大，使分析物离子化并以带单电荷或多电荷的离子形式进入质量分析器(图6-5)。,Electrospray,二、液相色谱电喷雾串联质谱,电喷雾离子源后连接串联质谱可检测离子结构碎片的质荷比，能够提供离子的结构信息。应用于多肽、核酸的测序及蛋白的鉴定和翻译后修饰分析。串联质谱仪主要由离子源、多级质量分析器及碰撞室组成。第一级质量分析器起质量过滤器的作用，即从总离子谱中挑选出需进一步进行结构分析的母离子进入碰撞室，母离子在碰撞室内经搞流速惰性气体碰撞诱导解离(collisioninduceddesorption，CID)产生碎片离子/子离子，由第二级质量分析器分析离子的质荷比。通过母离子和子离子的质量，研究二者关系及母离子的裂解规律，可以获得母离子的结构信息。,生物质谱仪常用的多级质量分析器有三级四级杆分析器(triple-quadrupoleanalyzer)、离子肼分析器(iontrapanalyzer)和四级杆-飞行时间质量分析器(quadrupole-timeofflightanalyzer)。,三级四级杆分析器由三个顺序连接的四级杆质量分析器(图6-7)组成，第一级和第三级四级杆分析器均可用离子选择和质量分析，中间的四级杆用于碰撞解离产生子离子。,离子肼分析器由三个双曲面电极围成一个离子捕集室(图6-8)。离子肼分析器集一级、二级分析器及碰撞室于一体，甚至可进行(MS)n串联分析。,四级杆-飞行时间质量分析器是由四级杆分析器和飞行时间分析器串联构成。四级杆-飞行时间质量分析器和电喷雾离子源相连构成的仪器称ESI-Q-TOF(图6-9)。,LC/IonTrap,电喷雾离子源可以方便地与高校液相色谱(HPLC)技术在线联用，在分析复杂混合物时很有优势，可以先分离再分析。液相色谱电喷雾串联质谱分析肽混合物鉴定蛋白质时，可以对每一个肽段进行序列分析，综合所有MS和MS/MS数据进行蛋白质，大大提高了鉴定准确度。图6-10是用LC-ESI-MS/MS分析肽混合物的实例，图6-10A是肽混合物的总离子流色谱图，图6-10B是肽混合物的总离子流质谱图，图6-10C和图6-10D是其中两个肽段的串联质谱图。,第三节肽质量指纹谱鉴定蛋白质技术,一、肽质量指纹谱鉴定蛋白质原理用肽质量指纹谱(peptidemassfingerprinting,PMF)鉴定蛋白质是目前蛋白质组研究中较为常用的鉴定方法。肽质量指纹谱是蛋白质被酶切位点专一的蛋白酶水解后得到的肽片断质量图谱，即用实验测得的蛋白质酶解肽段质量数在蛋白质数据库中检索，寻找具有相似肽质量指纹谱的蛋白质。基本路线如图6-11所示。,测定肽混合物质量数最有效的质谱仪是MALDI-TOF-MS，灵敏度高，谱峰简单，每一个谱峰代表一种肽段。但是蛋白质可能存在翻译后修饰，电泳过程中某些氨基酸会引入质量修饰(如甲硫氨酸氧化)，这样在蛋白质的PMF中就会有一些质量数与理论值不符，但PMF鉴定的好处就在于不需要将全部肽质量数的都与理论值相符。PMF法可同时处理许多样品，是大规模鉴定的首选方法。,用于制备肽谱的酶需具以下特点：酶的水解位点专一；酶切产生的蛋白的肽段大小适合质谱分析并利于数据库检索；酶自身稳定，不易自降解。用PMF检索数据库时，要提高检索准确度，则产生肽谱的酶切点至少要有2个，同时相对分子质量大于5000Da的肽片断对检索没有很大帮助。MALDI-TOF-MS适宜测量分子质量在500Da以上的分子，在几千道尔顿以内质量准确度较高。,二、凝胶电泳分离蛋白质PMF鉴定方法,我们用标准蛋白建立了PMF鉴定凝胶电泳分离蛋白质的方法，又在人肺巨细胞癌细胞蛋白和白血病细胞HL-60的鉴定中得到应用，凝胶电泳分离蛋白质PMF鉴定的步骤如下：a)考马斯亮蓝染色凝胶的脱色；b)银染凝胶的脱色；c)酶切；d)肽提取；e)数据库检索鉴定蛋白质。,检索时根据样品及仪器实际情况输入检索参数限制检索范围，主要有以下几条：数据库(database);蛋白种属(organismsspeciesororganismsclassification,OSorOC)；蛋白的等电点(pl)和相对分子质量(Mw)范围；半胱氨酸的质量修饰；肽质量数误差范围(masstolerance)；未水解的酶切位点数(maximumnumberofmissedcleavagesites，#MC)；最少相符的肽数目(minimumnumberofpeptidesrequiredtomatch)等。,三、凝胶电泳分离蛋白质PMF鉴定方法实例,图6-12时PMF鉴定双向电泳分离蛋白质的实例，此蛋白来源于人白血病细胞，经胰蛋白酶原位酶切，MALDI-TOF-MS分析得到PMF，经数据库检索鉴定为人丙酮酸激酶(KPY_HUMAN)。图中标有*的峰是在检索时与数据库中丙酮酸激酶肽质量数理论值相符的肽，图6-13为检索参数及检索结果。,用阴影标记的序列为检索所得蛋白肽段质量数理论值与实验测得PMF中质量数相符的肽段序列，质量数相符的肽段序列覆盖率为50.2%。,用PMF方法成功鉴定的关键是所测得肽质量数有足够的准确度，3000Da以下的质量数准确度至少要好于0.5。现在较好的MALDI-TOF-MS质谱仪在内标校正下已能达到5ppm的质量准确度，使检索鉴定成功率大大提高。但即使这样也不能成功鉴定所有蛋白质，有相当一部分蛋白质不能单纯靠PMF鉴定，还要结合序列信息