毕赤酵母培养基大全

毕赤酵母表达培养基的制备2.1 LB(Luria-Bertani)徽章：Trypton l%Yeast Extract 0.5%NaCl %PH 7.0做平板的时候加2%的琼脂粉。121 高压灭菌20min。可以在室温下保管。培养Ppcz a原核宿主细菌top 10 f时，可添加Zeocin 25ug/ml。2.2低Salt LB(LLB)徽章：Trypton l%Yeast Extract 0.5%NaCl 0.5%PH 7.0做平板的时候加2%的琼脂粉。121 高压灭菌20min。可以在室温下保管几个月。添加了用于培养Ppcz a原核宿主细菌top 10 f的Zeocin 25ug/ml，可在4 下保存1 2周。2.3 YPD(也称为YEPD)yeast extract pep tone dextrose medium，(yeast extract pep tone dextrose medium，酵母浸出粉/胰蛋白粉/右转葡萄糖培养基)Trypton 2%Dextrose (glucose) 2%Agar 2%Zeocin 100 g/ml液体YPD培养基可以在室温下保存。琼脂YPD板可以在4 下存储几个月。添加Zeocin 100ug/ml，成为YPDZ培养基，可在4 下存储1 2周。2.4 YPDS Zeocin徽章：Yeast extract 1%Peptone 2%Dextrose (glucose) 2%Sorbitol(山梨醇)1米Agar 2%Zeocin 100 g/ml无论是液体YPDS培养基还是YPDS Zeocin培养基，都要在4 保存1 2周。2.5 MGYMinimal Glycerol Medium(最低甘油徽章)(34% YNB；甘油1% 4*10-5%生物素)。将800ml灭菌水、100ml的10*YNB母液、2ml的500*B母液和100ml的10*GY母液混合储存到4 ，保存2个月。2.6 MGYHMinimal Glycerol Medium Histidine(最低甘油徽章0.004%组氨酸)在1000ml的MGY培养基中加入100*H母液，保存到4 ，保留期为2个月。2.7 RDReGENEration Dextrose Medium(葡萄糖再生培养基)(包括：1mol/L山梨醇；葡萄糖2% 1.34% YNB；4*10-5%生物素；0.005%氨基酸)186g山梨醇为700毫升，高压杀菌。冷却后在45水温下；3.100ml的10*D，100ml的10 * YNB2ml的500 * B；将10ml的100*AA等母液和88ml无菌水混合，预热到45 ，然后与步骤2的山梨醇溶液混合。保存到4 。2.8 RDHregeneration dextrose medium histidine(葡萄糖再生培养基0.004%组氨酸)在RD徽章准备的第三阶段，添加10ml的100*H母液，将杀菌剂的体积减少到78ml，剩下的将以RD相同的方式准备。保存到4 。2.9 RD和RDH板准备1.以186克山梨醇和15-20g琼脂粉为700毫升，进行高压杀菌。冷却后60水浴；2.参考RD/RDH液体徽章制造的步骤4为100ml的10*D，100ml的10 * YNB2ml的500 * B；10ml的100*AA等母液，(10ml的100*H母液)和88(78)ml无菌水混合预热到45 ，然后与步骤1的山梨醇/琼脂液体混合；3.迅速准备板。4 可储存数月。2.10 RD和RDH的TOP琼脂的制备(酵母常用的封装)1.将186g的山梨醇和7.510g的琼脂粉以700毫升，进行高压杀菌。冷却后60水浴；2.参考RD/RDH液体徽章制造的步骤4为100ml的10*D，100ml的10 * YNB2ml的500 * B；10ml的100*AA等母液，(10ml的100*H母液)和88(78)ml无菌水混合预热到45 ，然后与步骤1的山梨醇/琼脂液体混合；3.将TOP琼脂置于45水浴冷却，保温，备用。2.11 MD和MDHminimal dextrose medium(histidine)最低葡萄糖徽章(0.004%组氨酸)(包括：1.34% YNB；4 * 10-5%生物素；葡萄糖2%)1.100ml的10 * YNB2ml的500*B和100ml10*D母液是800ml的无菌数，一直到1000ml。准备MDH时，只需在上面的MD中添加10ml的100*H。3.对于模板，在灭菌前可以添加1520g的琼脂。4 可储存数月。2.12 SOC徽章：Trypton l%Yeast Extract 0.5%NaCl 0.05%Glucose (1mol/L) 2%121 高压灭菌20min，冷却后储存在4 2.13毫米徽章：M9母液：64g磷酸二钠、15g磷酸二氢钾、2.5g氯化钠、5.0g氯化铵和1L水杀菌M9母液200毫升水为700毫升，2毫升/l灭菌硫酸镁，100微升灭菌1毫升/l氯化钙(可追加)。硫酸镁和M9母液分别灭菌或沉淀。在M9培养基中添加0.5%葡萄糖，就成为MM培养基。2.14 BMGY /BMMY徽章：酵母粉：1.0克，蛋白胨：2.0克，YNB:1.34克，0.1毫升/L pH6.0(或pH7.0)磷酸缓冲液，甘油：1.0毫升，蒸馏水为100毫升2.15 BMM培养基，全名：Buffered minimal methanol是最少缓冲甲醇培养基，通常用于表达分泌蛋白。准备：100mM pH6.0磷酸钾1.34%YNB 410-5%生物素0.5%甲醇1.灭菌700毫升水，2.冷到室温，添加以下内容：100ml 1M pH6.0磷酸钾缓冲液，100ml 10YNB，2ml 500B，100ml 10M3.4度部署，2个月部署10YNB (13.4%酵母氮源碱(YNB)无含硫酸铵的氨基酸)将134gYNB溶解在1000ml水中，过滤细菌，用YNB加热，保存在4度。或者34gYNB(硫酸铵不含氨基酸)，用100g硫酸铵制造，可以放一年。毕赤酵母在高浓度YNB中生长得更好。YPD:最基本的培养；BMGY:诱导表达前培养；BMMY:归纳表达；MD:电转换后筛选。YEPD不能替换BMGY。因为有葡萄糖，这样剩下的葡萄糖会影响下一阶段的诱导表现。但是一种方法是用YPG培养基替代YEPD中的葡萄糖，用3%的甘油替代，这样可以降低成本。摇瓶不能与发酵罐相比，甘油残留抑制甲醇的使用。BMGY、BMMY杀菌以加入甲醇、磷酸钾、生物素。制造BMMY的时候，也不需要在过滤和灭菌后使用以5%去除菌的甲醇之前，将100%的甲醇添加到所需浓度。YNB是高压灭菌，没有问题，0.22um过滤，天冬氨酸和苏氨酸在高压灭菌后添加到培养基中；与YPD一起添加YPD可以灭菌，但时间不能太长，温度不能太高。一般121-125度12-15分钟就足够了。时间过长，温度过高会导致YPD结焦。葡萄糖和氮化合物在一起，很容易在制造培养基中产生禁忌的美拉德反应。颜色较深时，默认情况下不可用。或包含葡萄糖和/或YNB的培养基108度35min高压杀菌。少量发酵实际上将YNB和生物素从培养基成分中去除，其培养基价格便宜，操作方便，可以直接杀菌，效果好(不比YNB好)。如果使用玉米提取物、麦芽提取物、麦麸提取物等亲自配置的培养基，无需更换液即可维持酵母的营养需要。用无机盐大规模发酵可以更省钱。大规模发酵时，防止甲醇的流动加速过快。另外，使用纯氧不贵。武汉买缸600元左右，一瓶纯氧20元。一批估计3-4瓶氧气，约100h小时。关于选择Tryptone和Peptone:1)用培养E.coli的Tryptone代替Peptone，对一些酵母(如一般表达酵母)是绝对不行的。例如双杂交109，y187等表达酵母完全不好。(2)Tryptone和Peptone都营养不良，但营养不良。一般表达酵母可以在Tryptone上生长，生长状态在Peptone上生长不好。但是tryptone和peptone在内容上有点不同。没有别的区别。peptone的目的不是提供氮源，而是提供氮源，即培养基的YNB。3)要求条件不高的话，一般使用也可以。尽可能正常培养Peptone，difco，郑美公司的代表，甚至其他国产蛋白胨，大部分酵母。(4)包含Peptone的培养基颜色深，纯化表达蛋白时去除颜色，需要进行繁琐的后续处理。切换到Tryptone后，徽章的颜色与LB(液体)颜色几乎相似，并且后续处理更容易。Invitrogen指南介绍了pepttone的作用是防止目的蛋白被某些酶水解，添加到pepttone的目的是对竞争抑制目的蛋白进行水解。因为pepttone是小短肽和一些酶作用的基础。培养毕赤酵母(Pichia pastoris)，本书说信标储液是水溶液，但实际上信标不容易溶于水，可以用一些水浴加热。准备500BIOTIN stock解决方案(0.02%)的三种方案为：(1)懒人把生物素直接溶于离子间的水，放入栗子也基本溶解；2)，性急，溶液配制为0.02N的NaOH，容易溶解；3)，如果水温加热，温度不能高于50度。D-生物素是生物活性的生物素，也就是维塔米诺。在毕赤酵母代谢过程中，作为多种酶的辅助作用。YNB、酶、蛋白胨含有一定数量的生物素，但要进行高密度发酵，就必须添加，因此天然培养基通常不需要单独添加。MD，MM属于不含微量生长因子(如生物素)的基本培养基。所以一定要加上。附件：武器徽章公式BSM武器徽章：85% H3PO4 26.7ml/L卡斯4？2H2O 0.93g/LK2SO4 18.2g/LMgSO4？2H2O 14.9g/LKOH 4.13g/L甘油40g/LPMT1 4.0ml/L100% pH5.0 (50ml 1瓶800ul氨)或10g/L硫酸铵pH5.0，将氨用于罐pH(便宜且方便)。诱导表达前pH6.0。PH5.0旨在防止BSM形成磷酸钙沉淀，PH6.0是表达HSA融合蛋白的最佳pH。BSM高压灭菌后4.0m