PCR常见问题分析及对策

聚合酶链反应常见问题分析及对策(无扩增产物、非特异性扩增、拖尾、假阳性)问题1:没有扩增产物现象：阳性对照有条带，而样品没有原因：1.模板：含有低含量的抑制剂2.缓冲液不适合样品3.底漆设计不当或退化4.反应条件：退火温度太高，延伸时间太短对策：1.纯化模板或使用试剂盒提取模板DNA或增加模板剂量2.更换缓冲液或调整浓度3.重新设计引物(避免链间二聚体和链内二级结构)或更换新的引物管。4.降低退火温度，延长延伸时间问题2:非特异性扩增现象：条带与预期的大小不一致，或非特异性扩增条带原因：1.引物特异性差2.模板或引物浓度太高3.过量的酶4.Mg2浓度太高5.低退火温度6.周期太多对策：1.重新设计引物或使用套式聚合酶链反应2.适当降低模板或引物的浓度3.适当减少酶的用量4.降低镁离子浓度5.适当提高退火温度或使用两阶段温度法。6.减少循环次数问题3:拖尾现象：产品涂在凝胶上。原因：1.模板不是纯的2.缓冲不合适。3.低退火温度4.过量的酶5.5.dNTP和Mg 2的浓度太高。6.周期太多对策：1.纯化模板2.替换缓冲区3.适当提高退火温度4.适量的酶5.适当降低dNTP和镁离子的浓度6.减少循环次数问题4:假阳性现象：空白对照出现靶扩增产物原因：目标序列或扩增产物交叉污染对策：1.操作时要小心轻放，防止目标序列被吸进加样枪或溅出离心管；2.除了不能耐高温的酶和物质外，所有试剂或设备都应在高压下灭菌。使用离心管取样枪头应该是一次性的。3.各种试剂应先包装，然后低温保存。聚合酶链反应产物的电泳检测时间一般来说，在48小时内，有些最好在同一天通过电泳检测。超过48小时后，不规则条带模式将消失。假阴性，无扩增带聚合酶链反应的关键环节是：模板核酸的制备；引物的质量和特异性；酶的质量；聚合酶链反应的循环条件。为了找出原因，还应该对上述环节进行分析和研究。模板：模板含有杂蛋白；模板中含有Taq酶抑制剂；模板中的蛋白质没有被消除，尤其是染色体中的组蛋白；提取和制备模板时，蛋白质损失过多或吸入苯酚。模板核酸变性不完全。当酶和引物的质量好时，没有扩增区，这很可能是样品的消化机制。模板核酸的提取过程有问题。因此，为了制备有效和稳定的消化处理溶液，其程序也应该是固定的，不应随意改变。酶的失活：需要更换一种新的酶，或者需要同时使用两种酶来分析假阴性是否是由酶活性的丧失或不足引起的。应该注意的是，Taq酶或溴化乙锭有时会被遗忘。引物：引物的质量、引物的浓度以及两个引物的浓度是否对称是导致聚合酶链反应失败或扩增带不令人满意和容易分散的常见原因。一些批次的引物在合成质量上存在问题。一个引物具有高浓度，另一个具有低浓度，导致低效的不对称扩增。对策是：选择好的引物合成单位点。(2)引物的浓度不仅取决于OD值，还取决于引物原液的琼脂糖凝胶电泳。必须有引物带，两个引物带的亮度应该大致相同。例如，一个引物有条带，一个引物没有条带。此时聚合酶链反应可能会失败，应通过与引物合成单元协商解决。如果一个引物反应体积的变化：通常，用于聚合酶链反应扩增的体积为20微升、30微升和50微升。或100微升，根据科学研究和临床检测的不同目的设置用于聚合酶链反应扩增的大体积的应用。在制造小体积(例如20ul)然后制造大体积之后，条件必须是模制的，否则很容易失败。物理原因：变性对聚合酶链反应扩增非常重要，如变性温度低，变性时间短，很容易出现假阴性。如果退火温度太低，可能导致非特异性扩增并降低特异性扩增效率。如果退火温度过高，会影响引物和模板的结合，降低聚合酶链反应的扩增效率。有时需要使用标准温度计来检测扩增仪或水溶性罐中的变性、退火和延伸温度，这也是聚合酶链反应失败的原因之一。靶序列变异：如果靶序列发生突变或缺失，影响引物和模板的特异性结合，或者引物和模板由于靶序列某一片段的缺失而失去互补序列，则聚合酶链反应扩增将不会成功。假阳性聚合酶链反应扩增条带与靶序列条带一致，有时条带更规则、更亮。引物设计不合适：选择的扩增序列与非靶扩增序列具有同源性，因此在进行聚合酶链反应扩增时，扩增的聚合酶链反应产物是非靶序列。目标序列太短或引物太短，容易出现假阳性。引物需要重新设计。靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两个原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可通过以下方法解决：操作时要小心、轻柔，防止目标序列被吸进加样枪或溅出离心管。(2)除不能耐高温的酶和物质外，所有试剂或设备都应在高压下灭菌。所用的离心管和样品进料头应为一次性的。(3)必要时，在添加样品之前，用紫外线照射反应管和试剂以破坏现有的核酸。第二是空气中核酸的小片段污染，这些小片段比靶序列短，但具有一定的同源性。可相互拼接，与引物互补后，扩增产物可扩增产生假阳性，假阳性可通过套式聚合酶链反应减少或消除。出现非特异性扩增带聚合酶链反应扩增后的条带与预期大小不一致，或大或小，或同时出现特异性扩增条带和非特异性扩增条带。非特异性条带是由以下原因引起的：首先，引物与靶序列不完全互补，或者引物聚合形成二聚体。二是Mg2离子浓度过高，退火温度过低，聚合酶链反应循环次数过高。第二是酶的质量和数量。非特异性条带往往出现在其他来源的某些酶中，而不是其他来源的酶中。当酶的量太大时，有时会发生非特异性扩增。对策是：(1)必要时重新设计指南。(2)减少酶的量或更换另一种酶源。(3)减少引物数量，适当增加模板数量，减少循环次数。(4)适当提高退火温度或采用双温点法(93变性，65左右退火和拉伸)。出现片状拖带或涂抹带聚合酶链反应扩增有时会导致斑点或片状条带或地毯样条带。原因通常是酶太多或酶质量差、dNTP浓度太高、Mg2浓度太高、退火温度太低和循环次数太多。对策如下：减少酶的用量，或从其他来源替代酶。(2)降低dNTP的浓度。(3)适当降低Mg2的浓度。(4)增加模板数量，减少循环次数。克隆聚合酶链反应产品的最佳条件是什么？最佳插入片段：载体比率需要通过实验确定。11(插入物载体)通常是最佳比例，摩尔比为18或81。应确定比率范围。5ul 2X液体，50ng质粒DNA例如，凝胶分析只有一条扩增产物带，不需要凝胶纯化。如果可以看到其他的异带，它们可能是积累了大量引物的二聚体。少量引物二聚体的摩尔数也很高，这导致具有引物二聚体而不是靶插入物的克隆比例很高。因此，克隆前需要进行凝胶纯化。如果目标片段没有被回收，还需要什么其他对照实验？a)包被未转化的感受态细胞。如果有菌落，则表明氨苄青霉素无效，或氨苄青霉素耐药型质粒被污染，或产生氨苄青霉素耐药型菌落。b)转化完整的质粒，计算菌落生长数，并测量转化效率。例如，1ug/ul质粒1:100被稀释，1ul用于100ul感受态细胞转化。在用有机玻璃稀释到1000微升后，用100微升放置板。培养过夜，产生1000个菌落。转化率是：产生的菌落总数/浮游DNA的总量。浮游DNA的总量是用于转化反应的量除以稀释倍数。具体而言，使用10纳克的DNA进行转化，并且在用有机碳稀释至1000后包含10纳克的DNA，并且使用1/10板来共享1纳克的DNA。转化率为：1000个克隆x 10(3次方)ng/平板1 ng DNA ug=10(6次方)cfu/ug以转化pGEM-T如果使用10(8次方)cfu/ug感受态细胞，如果没有集落或集落少，感受态细胞的转化率太低。c)如果使用pGEM-T阳性对照或聚合酶链反应产物产生20-40个蓝点(cfu/ug具有指定步骤10(功率8)的感受态细胞)，载体失去T。连接酶可能污染了核酸酶。T4 DNA连接酶(M1801、M1804、M1794)具有良好的质量标准，没有核酸酶污染，并且没有被来自其他来源的T4 DNA连接酶替代。d)将pGEM-T阳性对照与pGEM-T或pGEM-T简易载体连接，以转化高频感受态细胞(10(8次方)cfu/ug)。根据规定的实验步骤，可以获得100个菌落，其中60%应该是白斑。如果产生20-40个蓝点，则没有菌落或很少菌落，并且连接有问题。对照实验结果良好，但目标片段未被回收。这个实验有什么问题？a)连接在室温下保持1小时，这可以满足大多数克隆。为了提高效率，一夜之间需要40摄氏度。b)插入片段被污染，导致3-t缺失，或抑制连接和转化。为此，将插入片段和pGEM-T阳性对照混合并连接。如果对照的菌落数减少，插入的片段需要纯化或再次制备。如果产生大量蓝点，插入片段被核酸酶污染，并且pGEM-T或pGEM-T易载体3-T被删除。c)插入的片段不适合连接。由于紫外线照射过度，偶尔会出现通过凝胶纯化的插入片段。过多的紫外线照射会产生嘧啶二聚体，这不利于连接。脱氧核糖核酸必须再次纯化。d)具有修复功能的热稳定的DNA聚合酶的扩增产物的末端没有，这是克隆pGEM-T或pGEM-T简易载体所必需的。加入聚合酶和核苷酸可以在末端加一个。如需了解详情，请查看易运公司(TM042)的技术数据。e)高度重复的序列可能不稳定，导致扩增过程中的缺失和重排。如果发现插入经常产生缺失和重排，则需要重组缺陷大肠杆菌菌株，如SURE细胞聚合酶链反应故障排除当聚合酶链反应结果不令人满意时，首先检查以下方面并遵循它们：用于聚合酶链反应的试管紧紧地附着在反应板上。当酶反应混合物开始以70循环时“热启动”，记得在加入酶后稍微振荡，因为在0.2毫升的聚合酶链反应管中热传递不能均匀。不要随意减少dNTP的用量。这是一个系统因素，必须与其他因素相平衡。对于有问题的聚合酶链反应，如少量模板、不纯模板和环状模板，系统在加入Taq酶之前进行预变性，然后加入模板进行正常的聚合酶链反应扩增。无扩增产物：在提供氯化镁缓冲溶液时，氯化镁的浓度以0.25摩尔/升的梯度增加；没有氯化镁的缓冲溶液中氯化镁的浓度以梯度增加减少循环次数或模板DNA的数量。提高退火温度，但不要超过68。重新设计引物或设计更长的引物。其他值得注意的情况：建议使用0.2毫升薄壁管。厚壁管在92下不能有效地使模板变性。最佳反应体积为50毫升，建议用30毫升矿物油覆盖(可不加盖加热的聚合酶链反应仪)。在大多数反应中，0.75毫升(0.5 1毫升)的酶量在大多数情况下可以获得令人满意的结果。建议使用1.75 mmol/l mgcl2: 350 mmol/l dntp或2.25 mmol/l mgcl2: 500mm ol/l dntp的混合物。然而，为了获得最佳结果，有必要优化Mg2的浓度。基因组DNA模板的质量显著影响聚合酶链反应。因此，琼脂糖凝胶电泳被推荐用于检测DNA的长度。DNA片段长度可超过50kb，传统的基因组DNA可将片段扩增至10kb。应该使用超纯或高分子量的脱氧核糖核酸来扩增更长的片段。请参阅高分子量脱氧核糖核酸提取过程的相关文件。降低二级结构和引物二聚体形成的可能性。进行长片段聚合酶链反应扩增时，引物长度一般为24-34个核苷酸，熔点为60-68.使用这种引物可以提高聚合酶链反应的退火温度，从而提高反应的特异性。这非常重要。长片段的扩增效果通常受到非特异性短片段的优先扩增的影响。变性：变性的第一步在94进行2分钟。在循环过程中，变性时间尽可能缩短(在94下20-30秒)，除非气相色谱富含模板，否则变性在95下进行30秒。这可以防止脱氧核糖核酸退化和链断裂。当待扩增的基因组DNA片段的最终长度超过12 kb时，应尽可能降低变性温度。延伸：在68-72进行延伸操作。循环扩展：尝试使用循环扩展的条件。如果聚合酶链反应仪器没有这种功能，延长时间必须增加。例如，当10kb片段被扩增时，延伸时间是10分钟而不是8分钟。通过长片段聚合酶链反应系统扩增的片段在其3末端有一个突出的，因此建议进行T/A克隆。为了进行整平和拉伸，在进行整平之前，可以用克列诺酶和T4 DNA聚合酶整平聚合酶链反应产物。测序时，由于混合酶具有35 核酸外切酶活性，用桑格法测序不能产生统一的(染色体)条带模式。底漆设计：一般长度为20-30bp；气相