PCR技术培训讲座.ppt

聚合酶链反应技术培训、疾病诊断、分子诊断、影像诊断、细胞/组织诊断、临床诊断、免疫诊断、生化诊断，几乎所有的疾病都是遗传病，科学研究已经证明，基因可以揭示疾病的本质，几乎所有的人类疾病都与基因直接或间接相关，从某种意义上说都是遗传病，基因：基因是具有遗传效应的DNA片段，是控制性状的遗传物质的功能单位。遗传效应指的是能被转录成信使核糖核酸，然后被翻译成蛋白质，或者被转录成核糖体核糖核酸的功能。运输核糖核酸。1985年，美国的卡里穆利斯发明了一种在体内模拟DNA复制过程和在体外复制特定DNA片段的方法，并将其命名为聚合酶链式反应(PCR)。聚合酶链反应可以在短时间内将极少量的脱氧核糖核酸(理论上，一个就足够了)加倍到一百万或十亿倍。通过聚合酶链反应，可以从少量的生物材料中容易、快速地获得大量的特异性核酸，具有较高的灵敏度和特异性，可用于检测少量的核酸样品。聚合酶链反应技术，聚合酶链反应技术被科学界誉为生物技术领域最伟大的发明之一。美国人莫里斯在发明这项技术后不久就获得了1993年诺贝尔化学奖。聚合酶链反应及其相关技术于20世纪80年代末开始在国外应用：欧洲共同体(现为欧盟)、日本和美国相继将聚合酶链反应作为核心基因诊断技术纳入献血者筛查，美国食品和药物管理局已批准60多种基因诊断试剂用于临床，美国国家疾病控制中心已将聚合酶链反应技术纳入常规疾病诊断技术。1。脱氧核糖核酸变性(90-96):双链脱氧核糖核酸模板在加热下断裂氢键形成单链脱氧核糖核酸2。退火(25-65):系统温度降低，引物和DNA模板结合形成局部双链。3.延伸(70-75):在Taq酶(72时活性最高)的作用下，以脱氧核糖核酸为原料，从引物的5-末端3-末端延伸，合成与模板互补的脱氧核糖核酸链。经过变性、退火和延伸后，每个循环中的DNA含量都增加了一倍。标准的聚合酶链反应过程分为三个步骤。荧光聚合酶链反应检测技术是在传统聚合酶链反应技术的基础上，加入荧光标记的基因探针，通过探针与扩增产物的结合释放荧光信号，然后通过专用仪器(荧光聚合酶链反应仪)实时检测荧光信号。经过计算机分析，可以准确计算出目标基因的初始数目，实现定量检测。与传统的聚合酶链式反应检测相比，荧光聚合酶链式反应检测技术不仅实现了从定性到定量聚合酶链式反应检测的飞跃，而且具有特异性强、能有效解决聚合酶链式反应污染问题、自动化程度高等特点。因此，荧光PCR检测技术自20世纪90年代中期出现以来，已经成为最具代表性的PCR检测技术。它为聚合酶链反应检测技术的临床应用打开了方便之门，并得到了广泛应用。荧光聚合酶链反应检测技术简介，短手柄圆形探针荧光聚合酶链反应原理，分子信标是一种荧光标记的寡核苷酸链，一般含有25 35个核苷酸。在结构上，分子信标通常可分为三部分：(1)环状区域：通常由15-30个核苷酸组成，可特异性结合靶分子；(2)茎区：一般由5 8个碱基对组成，在分子信标和靶分子的结合过程中可发生可逆解离。(3)、荧光团和猝灭基团：荧光团通常连接在5端；淬灭基团通常连接在3端，4-(4-二甲基氨基偶氮苯基)苯甲酸(DABCYL)通常用作淬灭基团。根据福尔斯特理论，中心荧光能量转移效率与两者之间距离的6次方成反比。因此，只有当荧光基团和淬灭基团之间达到一定距离时，才会出现荧光。荧光标记，荧光发光是通过激发光激发荧光基团达到高能态，然后产生发射光。常用的有绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白DsRed、CY3、CY5、FAM等荧光报道基团，探针荧光标记和荧光基团如红色荧光Cy3和绿色荧光Cy5标记的探针淬灭基团通常是4-(4-二甲氨基偶氮苯基)苯甲酸(DABCYL)，它们是影响分子信标的主要因素。在分子信标中，荧光基团和猝灭基团之间的距离是影响分子信标的最重要因素。根据福尔斯特理论，荧光基团和猝灭基团之间的距离直接影响荧光强度。此外，温度也是影响分子信标的一个重要因素。只有在较低的温度下，分子信标才能保持其发夹结构。在更高的温度下，分子信标将不能保持其发夹结构，甚至使其拉伸成随机的线性形状，导致荧光基团和淬灭基团分离，从而发射荧光并呈现假阳性结果。文献表明，熔化链的温度取决于茎区的长度、缓冲溶液的G-C含量和离子强度、试剂盒的组成、1。痰DNA提取物2、聚合酶链反应反应溶液结核引物1和2、结核探针、TaqE、缓冲液(10毫摩尔/微升-盐酸)、脱氧核糖核酸、内参照模板、内参照引物1和2、内参照探针、石蜡油3、聚合酶链反应增强剂：氯化镁24、强阳性对照：结核分枝杆菌阳性质粒(或卡介苗)5、弱阳性对照：结核分枝杆菌阳性质粒(或卡介苗)6、阴性对照：超纯水、聚合酶链反应反应特性、强特异性和高灵敏度。聚合酶链反应产物的产量呈指数级增长，这可以将待测的初始模板放大到微微克(pg=10-12)至微克(ug=-6)。从一百万个细胞中可以检测到一个目标细胞；在病毒检测中，聚合酶链反应的灵敏度可达3 RFU(斑块形成单位)。细菌学的最低检出率是3个细菌。耐高温聚合酶链反应用于简单快速的聚合酶链反应。反应液加入一次后，在DNA扩增液和水浴罐上进行变性-退火-延伸反应，扩增反应一般在2-4小时内完成。扩增产物通常通过电泳进行分析，不需要同位素。无放射性污染，易于推广。不需要分离病毒或细菌和培养细胞，并且粗制的DNA产物和核糖核酸可以用作扩增模板。可通过临床标本如血液、体腔液、冲洗液、毛发、细胞、活组织等的DNA扩增直接检测。荧光聚合酶链反应-结核检测试剂盒的生产工艺、试剂盒的检测操作方法、所有临床诊断用的聚合酶链反应检测应在卫生部批准的临床基因诊断实验室进行，用于核酸分离提取试剂的制备、扩增和检测、实时荧光聚合酶链反应结果的解释、荧光聚合酶链反应试剂盒的检测结果、三种方法的痰标本检测结果、GAPDH、A、B、Ct=cther2/neu-ctgadph、her2/neu、荧光阈值的设定。 前15个循环的荧光信号作为荧光背景信号，荧光阈值是PCR3-15个循环的荧光信号标准差的10倍，即阈值=10 sdcycles 6-15。 荧光阈值设定在聚合酶链反应扩增的指数期。结核分枝杆菌的特异性检测和Ct值在荧光定量聚合酶链反应技术中有一个非常重要的概念Ct值。c表示周期，t表示阈值，Ct值表示每个反应管中的荧光信号达到设定阈值时经历的周期数。模板的Ct值和模板起始拷贝数的对数之间存在线性关系。Ct值越小，起始拷贝数越多，反之亦然。可以通过使用具有已知起始拷贝数的标准产品来绘制标准曲线，其中横坐标表示起始拷贝数的对数，纵坐标表示ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，就可以从标准曲线计算出样品的起始拷贝数。聚合酶链反应诊断试剂的生产和管理要点：1 .用于处理和包装阳性血清(或阳性质粒)的分离实验室；2.PCR试剂生产区和验证区严格分开；3.合理性内部包装：试剂是否泄漏，真空包装是否损坏，试剂是否完整，是否有使用说明等。试剂灵敏度：取一份卫生部临床检验中心购买的已知拷贝数的血清，稀释至10份，用新试剂检测并计算灵敏度。试剂重复性：从卫生部临床检验中心购买一份已知拷贝数的血清，用新试剂稀释，平行检测10次，计算标准差和变异系数%。变异系数%应该是30%。试剂特异性：取10份临床标本(包括2份低拷贝标本、2份高拷贝标本、2份阴性标本和2份高黄疸标本)，用新试剂进行检测，探讨试剂的特异性。一、荧光定量聚合酶链反应内部质控程序，每天门诊采血时，必须仔细核对检验单和患者姓名是否一致。实验室检验单编号编制完成后，对血液标本进行编号时，应仔细核对实验室检验单上的患者姓名和标本管上的姓名，不得有误。在每次试验中，必须同时测定一个阴性对照和一个对照。第一次制作质量控制图时(新批号开始时)，采用“即时法”质量控制方法，具体步骤如下：将连续质量控制测量值从小到大排列，即X1、X2、XN计算平均值(X)和标准偏差计算国际单位制上限和国际单位制下限国际单位制上限=(X最大值-X平均值)/2SI下限=(X平均值-X最小值)/2。为什么要为聚合酶链反应定量设置内部参考？影响聚合酶链反应定量的主要原因有：1 .反应效率的差异可能是由反应系统和聚合酶链反应扩增仪器的工作条件造成的。由于聚合酶链反应产物的增加是以指数方式进行的，即使扩增效率的差异很小，产物的浓度也会有很大的变化。解决的办法是建立一个内部控制，使参考基因可以在同一个反应管中通过聚合酶链反应进行扩增，起到校正作用。这样，任何影响扩增效率的因素也会影响两个模板。2.最终产品浓度的影响：最终产品浓度达到一定水平后，将不再保持指数增长，而是进入一个平稳期。溶液：稀释要连续测试的模板或在一定的聚合酶链反应反应期后间隔测量聚合酶链反应最终产物的浓度。聚合酶链反应诊断试剂质量控制要点，1。酶活性的测定，2。引物序列的测定，3。严格分离PCR样品应用区、扩增区和检测区，4。选择特异、灵敏、简单、快速的聚合酶链反应产物检测方法。脱氧核糖核酸聚合酶的活性和稳定性符合某些要求，并有固定的来源。聚合酶链反应产物检测方法应尽可能可靠、快速和方便。聚合酶链反应试剂盒检查员应经过专门培训，以产生质量检测方法。引物20%聚丙烯酰胺凝胶电泳应该只有一个单一的带。用紫外分光光度计测定A260/A280应在1.5 1的范围内。分子信标探针的质量控制，Taq酶1的质量控制，稳定性：将置于37下7天的实验用Taq酶与正常条件下的Taq酶进行比较，测定室内质控品B和G系列，所有B系列样品均为阴性，荧光强度低于50；G系列样品应能测量1fg/ulDNA，待测酶的相对荧光强度与对照酶测量的100fg/ulDNA的平均值相比波动不超过15%。2.活性比较：将待测Taq酶与对照Taq酶进行对比实验，确定室内质控品的B、G系列。所有B系列样品均为阴性，荧光强度低于50；G系列样品应能测量1fg/ulDNA，待测酶的相对荧光强度与对照酶测量的100fg/ulDNA的平均值相比波动不超过15%。基因诊断的市场前景，基因诊断技术产品是重要的医学生物技术产品。生物技术是影响国家的四大科学支柱之一、聚合酶链反应假阴性和假阳性原因、假阴性：操作不当、试剂质量差(包括引物和探针设计不当)或过期、仪器设备假阳性不准确：几乎都是由污染、市场容量和基因诊断发展前景造成的。美国杂志自然遗传学于2002年9月27日发表的一份调查报告列出了十种最有希望在未来5至10年内改善世界各国人民健康状况的关键生物技术，特别是发展中国家。这项调查综合了全球28位知名专家的意见，历时五个月完成。根据调查报告，在十大关键生物技术中，第一项是传染病的分子诊断技术，包括聚合酶链反应、单克隆抗体等技术。根据2001年国外著名杂志自然和科学发表的文章和国际权威技术评估机构