常规分子生物学操作要点12.5.5.ppt

常规分子生物学操作要点,杨靓2011年12月5日,重组DNA技术的原理,重组DNA技术是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序也称为分子克隆技术,基因克隆或基因工程供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元件,DNA的体外重组,4,EcoR,回文序列palindromicseq,限制性核酸内切酶,粘性末端cohensiveend,平末端bluntend,DNA连接酶（DNAligase）,DNA连接酶催化双链DNA一端3-OH与另一双链DNA的5端磷酸根形成35磷酸二酯键，使具有相同粘性末端或平端的DNA两端连接起来。,限制性内切酶识别的靶序列与DNA的来源无关，任何不同来源的DNA，经过适当限制酶处理后，都能通过它们的粘性或平齐末端连接起来，这是DNA重组技术的基础,重组DNA分子的转化,转化是指将质粒或其他外源DNA导入处于感受态的宿主细胞，并使其获得新的表型的过程。转化常用的宿主细胞是大肠杆菌。增殖转化细胞，使得有足够数量的转化细胞用于筛选程序,阳性克隆的筛选和检测,阳性克隆的检测方法,抗药性标记选择蓝白斑筛选分子杂交法插入片段大小的鉴定（酶切，PCR）测序-,实验设计所需的各种DNA片段及其排列次序ORF酶切位点实验方法和操作,DNA体外重组技术,基因工程的操作过程,目的基因的获取,克隆载体的构建,外源基因与载体的连接（体外重组）,重组DNA导入受体菌,转化子的筛选和鉴定,克隆基因的表达,目的基因的克隆,基因工程或DNA重组技术的前提条件是从生物体中分离克隆目的基因。一般来说，目的基因的克隆战略分为两大类：一类是构建感兴趣的生物个体的基因文库，即将某生物体的全基因组分段克隆，然后建立合适的筛选模型从基因组文库中挑出含有目的基因的重组克隆；另一类是利用PCR扩增技术甚至化学合成法体外直接合成目的基因，然后将之克隆表达。,核酸的提取及检测,就基因工程而言，核酸分子是其研究所涉及的主要对象，所以核酸的分离与提取是研究中很重要的基本技术。核酸样品的质量将直接关系到实验的成败。,基因组DNA的分离与纯化,DNA主要存在于细胞核的染色体中。核外也有少量DNA，如线粒体DNA（mtDNA），叶绿体DNA（cpDNA），质粒DNA。总的原则保证一级结构的完整性排除其它分子的污染,一般步骤,(1)破碎细胞，裂解细胞壁机械方法:超声波处理、研磨、匀浆化学方法:SDS（阴离子去垢剂）EDTA，使得DNase失活(why?)酶学方法:溶菌酶或蜗牛酶(2)通过蛋白质变性或分解，使DNA游离出来(3)分离DNA,cDNA的分离与纯化,（1）mRNA分离RNase，不需辅助因子，耐酸碱，分布极广RNase的来源外源：操作者，实验器皿，试剂，空气内源：不同组织和细胞数量不同创造无RNase的环境DEPC(焦碳酸二乙酯异硫氰酸胍Trizol试剂,18,（2）Thefirststrandsynthesis,cDNA第二链的合成方法置换合成法,利用第一链在反转录酶作用下产生的cDNA:mRNA杂交链，不用碱变性（水解mRNA），而是在dNTPs存在下，利用RNA酶H在杂交链的mRNA链上造成切口和缺口。从而产生一系列RNA引物，使之成为合成第二链的引物，在大肠杆菌DNA聚合酶的作用下合成第二链。,注意：反转录酶除了具有聚合活性，还有RNaseH（降解DNA/RNA中的RNA）活性。,cDNA第二链的合成方法置换合成法,该方法使用较多,质粒DNA的分离与纯化,质粒plasmid:指细菌细胞质中独立于细菌染色体之外能自主复制的遗传单位共价闭合环状质粒DNA的分离：细菌培养和质粒DNA扩增；细菌菌体的裂解；质粒DNA的分离,质粒DNA碱裂解法原理,染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分子，而质粒DNA为共价闭合环状分子；当用碱处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共价闭环的质粒DNA在回到中性pH时即恢复其天然构象；变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。,核酸的检测,包括DNA的质量、大小、纯度检测分光光度计法dsDNA：1A26050ug/mlssDNA，RNA：1A26040ug/ml寡聚核苷酸：1A26020ug/mlA260/A2801.651.85（DNA）；2.0(RNA)比值高，有蛋白质、酚类等污染凝胶电泳法,原理,电泳及迁移率核苷酸链多聚阴离子在生理条件下，核酸分子的糖一磷酸骨架中的磷酸基团，是呈离子化状态的。相同分子量的双链DNA几乎具有等量净电荷无反应活性的稳定的介质降低了对流运动，故电泳的迁移率又是同分子的摩擦系数成反比的。已知摩擦系数是分子的大小、极性及介质粘度的函数，分子大小的不同、构型或形状的差异，所带的净电荷的多寡，便彼此分离开来。,琼脂糖凝胶电泳,琼脂糖为线性多糖聚合物，红色海藻产物琼脂中提取而来。琼脂糖溶液加热到沸点后冷却凝固，密度由浓度决定的。分辨能力同凝胶的类型和浓度有关:琼脂糖凝胶分辨范围为0.250kb之间.,不同浓度琼脂糖凝胶的分辨能力,电泳装置,凝胶电泳的优点,它不单是一种分析的手段，同时也可以用来制备和纯化特定的DNA片段。在这方面，低熔点（LMP）的琼脂糖凝胶较为方便。LMP琼脂糖是一种熔点为6265的琼脂衍生物，它一旦熔解，便可在37下持续保持液体状态达数小时之久，而在25下也可持续保持液体状态约10分钟。LMP琼脂糖可以不经电洗脱或破碎凝胶，即可用来回收DNA分子。,常用的指示剂有溴酚兰和二甲苯青及银染色.溴酚兰在碱性液体中呈紫兰色，在0.6%、1%、1.4%和2%琼脂糖凝胶电泳中，溴酚兰的迁移率分别与1Kb、0.6Kb、0.2Kb和0.15Kb的双链线性DNA片段大致相同。二甲苯青的水溶液呈兰色，在1%和1.4%琼脂糖中迁移速率分别与2Kb和1.6Kb的双链线性DNA相似.指示剂一般与蔗糖、甘油组成载样缓冲液.作用有增加样品密度.在电泳中形成肉眼可见的指示带，可预测核酸电泳的速度和位置.使样品呈色，加样操作更方便,指示剂,溴化乙锭染色,溴化乙锭（ethidiumbromide，简称EtBr），是一种具扁平分子的核酸染料，在一切可能的部位同DNA分子结合，却不能同琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶结合并在300nm紫外光照射下放射出，可显现凝胶中0.05ug的微量DNA方法：加入凝胶中，凝胶浸泡重要的特性：荧光强度同DNA片段的大小或数量成正比。在包含有数种DNA片段的电泳谱带中，每一条带的荧光强度是随着从最大的DNA片段到最小的DNA片段方向逐渐降低的。,操作过程,DNA分子大小的检测,NEB，1KbDNALadder：3kb=62.5ng，1kb=21.0ng,提高转基因植物中外源基因表达的策略,转录水平使用高表达启动子、增强子等表达调控元件。翻译水平使用翻译增强元件和植物偏爱密码子。翻译后水平将转基因产物定向表达在一个合适的细胞分隔。,SCMRP基因设计、合成,根据大豆密码子用法分析结果，对富含甲硫氨酸玉米醇溶蛋白基因序列进行重新编写，并在基因的5端依次设计添加omega、AACAATG序列，基因3端依次设计添加加尾信号序列、剪切序列；获得改造的富含甲硫氨酸蛋白质基因序列SCMRP（专利申请号：200410043869.0）,图3植物表达载体pBENM的构建,图4植物表达载体pBENM酶切鉴定结果M：核酸分子量标准DL15000；泳道1：质粒pUMAXbaI和SacI双酶切产物；泳道2：质粒pBENTXbaI和SacI双酶切产物；泳道3：质粒pBENMXbaI和SacI双酶切产物。,ORF,酶切位点通过克隆载体引入酶切位点通过PCR引入酶切位点（需测序）部分酶切Adaptor的使用克隆的先后次序,通过克隆载体引入酶切位点,部分酶切,Adaptor的使用,通用植物表达载体pBHT-5的构建,衔接头设计BS1:5-GATCCGTACGTGGCCATTA-3BS2:3-GCATGCACCGGT-5SS1:5-CGGCCGACTGGAGCT-3SS2:3-GGAGCCGGCTGACC-5,克隆的先后次序,实验方法和操作质粒DNA的提取酶切与回收连接转化转化子的鉴定,质粒DNA的提取,采用碱变性小量提取法：挑取单菌落，加5ml含有相应抗生素的LB液体培养基，37，200r/min，振荡培养过夜。将菌液加入1.5ml离心管，4000r/min，离心5min，尽可能弃去上清。加100L溶液，强烈振荡至细胞均匀分散，室温放置5min。加200L溶液，颠倒混匀，动作要轻，冰浴5min。加150L溶液，颠倒23次混匀，冰浴5min。4，12000r/min，离心10min，将上清移至新管，小心不要将沉淀吸入。用等体积苯酚氯仿抽提。4，12000r/min，离心5min。上清移至新管，小心不要吸入苯酚氯仿。加两倍体积95%的冰乙醇，颠倒混匀，4，12000r/min，离心10min。用70%乙醇清洗沉淀。倒掉乙醇，吹干。加入适量TE溶解电泳检测。,酶切与回收,双酶切体系的建立DNA的质量（不需要加大酶量）凝胶重量回收片段的质量（大片段降解？连接比）,连接,连接体系（需要调整）载体和DNA片段的大小PEG的添加（T载体、平末端连接）连接条件：温度（粘性、平末端）4度、16度、22度1MNaCl（转化）,转化子的鉴定,PCR技术要点引物的设计PCR反应体系PCR反应条件,PCR技术,PCR技术的应用基因的分离和克隆基因修饰、改造转基因植株检测,引物设计的原则（一）,引物长度：15-30bp，常用为20mer左右引物的有效长度不能大于38mer，否则最适延伸温度会超过TaqDNA聚合酶的最适温度（72），不能保证PCR扩增产物的特异性。引物扩增跨度：以500bp为宜特定条件下可扩增长至10kb的片段。引物碱基：G+C含量以40-60%为宜G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。,引物设计的原则（二）,避免引物内部出现二级结构避免两条引物间互补，特别是3端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异性的扩增条带（热启动PCR）。引物3端的碱基要求严格配对特别是最末及倒数第二个碱基，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。引物中有或能加上合适的酶切位点被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。,引物设计的原则（三）,引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量：每条引物的浓度0.11umol或10100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好。引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。对于比较复杂的实验，多设计几对引物配合使用是很有效的（巢式PCR）。,Mg2+浓度,Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响。在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.52.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低TaqDNA聚合酶的活性，使反应产物减少。,退火(复性)温度与时间：,退火温度是影响PCR特异性的较重要因素变性后温度快速冷却至4060，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。复性温度=Tm值-(510)在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。（梯度降落PCR）复性时间一般为3060sec，足以使引物与模板之间完全结合。,延伸时间：,根据所用Taq酶种类和待扩增片段长度而定使用有校读功能的酶应延长延伸时间；1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min就足够了；34kb的靶序列需34min；扩增10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些,基因克隆的一种方法RACE,基于同源序列的克隆技术,已克隆的一些基因（转录因子、蛋白激酶类的基因）在氨基酸水平上表现出一定程度的相似性，在一些区段高度保守，这些保守的结构区不仅有助于基因的分离及作用机理的理解，而且也为基因克隆提供了一条快捷途径。这就是基于同源序列的候选基因法（homology-basedcandidategenemethod）。其基本思路是：根据已知克隆的保守区设计简并引物，对基因组DNA进行扩增，得到该基因的类似序列，检测这些序列与性状共分离情况。如果这些序列与性状紧密相关或带有该基因功能结构区序列，则可用于其作为探针筛选基因组文库，获得候选基因；或者通过扩增末端的方法克隆全长基因。,SequenceanalysisofgeneGsCBRLK,ByPh.D.LiangYang,SequenceanalysisofgeneGsCBRLK,ByPh.D.LiangYang,Thehydrophilicresidueswereillustratedascircles,hydrophobicresiduesasdiamonds,potentiallynegativelychargedastriangles,andpotentiallypositivelychargedaspentagons.Hydrophobicityiscolorcodedwithgreen(themosthydrophobicresidue)andyellow(zerohydrophobicity)withtheamountofgreendecreasingproportionallytothehydrophobicity.Hydrophilicresiduesarecodedredwithpureredbeingthemosthydrophilic(uncharged)residue,andtheamountofreddecreasesproportionallytothehydrophilicity.Thepotentiallychargedresiduesarecodedlightblue,Fig.2AhelicalwheelprojectionpredictionofCaMBDinproteinGsCBRLK,目前，这种方法已引起国内外学者的广泛关注。在抗病方面已经应用很广泛，已在大豆，马铃薯、水稻、小麦、大麦、番茄和玉米中分离到了许多于已知抗病基因同源的DNA片段。在植物渗透胁迫相关基因的克隆方面，Urao等利用这一方法，根据蛋白激酶保守功能结构区和CDPK特有的E-F手性结构区序列设计简并引物，从拟南芥中分离了编码CDPK的2个cDNA克隆(cATCDPK1和cATCDPK2)，并通过功能分析验证了这两个基因在植物抗渗透胁迫中的作用。这些研究证明了同源性克隆技术分离植物抗逆性基因的可行性。,基因克隆的一种方法RACE,RACE的基本概念不同厂家RACE试剂盒的介绍RACE技术的关键环节存在的问题及解决办法,RACE的基本概念,cDNA末端快速扩增(rapidamplificationofcDNAends,RACE)技术是基于PCR技术由已知的部分cDNA序列来获得完整cDNA序列的一种方法，为Frohman在1985年首次报道。3RACE和5RACE介绍一下不同公司生产的RACE试剂盒的特点,3RACE原理示意图,3CCCC,原理示意图,3,5,RACE技术的关键环节,RACE技术的关键环节有2个：3个连续的酶促反应(逆转录、TdT加尾、PCR扩增)RACE的引物即使3个酶促反应均平稳顺利进行，但结果也通常会出现一些非特异性产物或非全长的产物背景。,存在的问题及解决办法,反转录RNA的质量有高质量的不被核糖核酸酶降解的RNA，RNA的完整性至关重要。一旦RNA降解就要重新提取，免得后期工作没有结果既浪费时间又浪费试剂，给试验带来麻烦。反转录提前终止模板中有特殊的二级结构，反转录提前终止。通过提高反转录的温度，加大反转录的反应体系以及反转录过程中一直保持已变性的RNA模板处于50以上，避免以解开二级结构的RNA再恢复原来的结构，以达到5末端。,提供一种改进的反转录方法,在RNase-free的0.2mLEppendorf管中加入以下成分：Oligo(dT)(0.5g)1LTotalRNA(45g)3LDEPC-H2OTo25L混匀，70保温10min；50保温5min；稍微离心一下。在混合物中，依次加入以下成份：10XSS（SS）Buffer5.0L10mMdNTPmix1.0L0.1MDTT2.0LRNaseInhibitor(40U/L)1.0LDEPC-H2OTo24L轻轻混合，在50保温5min后，在50下将3号管中的混合成分移入2号管中。每个反应加入1LSuperScriptTM（SS），轻轻混匀，50反应50min。70放置15min以终止反应。-20保存。,TdT加尾反应及其替代反应首先在反转录后，一些无用的核苷酸和过多的cDNA引物的存在会干涉加尾的成功，降低目的cDNA加尾的有效性，从而导致第二链cDNA合成效率的降低。其次，TdT反应难以控制，所有的cDNA都被加尾，而不管是否是全长cDNA，这样产生的非全长的cDNA将和全长产物一起完成PCR反应，而且会优先扩增，不能保证在PCR反应中有足够的全长产物能被探测。,TdT加尾反应及其替代反应第三，若目的cDNA中含有与多聚尾互补的几个核苷酸同聚区，则在合成第二条cDNA链时引物的延伸会从内部序列而不是末端序列开始，产生非全长的第二条cDNA链。我们所使用Invitrogen公司的RACE试剂盒，采用PCR介导的连接反应，在一定程度上避免了以上的问题。RACE试剂盒中末端转移的是多聚C尾，这样在反转录合成第一链时5端多聚G的二级结构影响反转录的彻底进行，会产生提前终止反应。我们改进了加尾的程序，用TdT酶加上多聚T尾，结果降低了反转录的难度，两个基因最终均获得了完整的5末端。,RACE引物的设计在实验过程中总结如下经验：引物不能设计在保守区简并引