肿瘤标志物检测原理及常见问题分析PPT参考幻灯片

肿瘤标志物定量检测试剂原理及常见问题,上海透景生命科技有限公司质量管理部杨恩环2015-02-03,本次讲解内容,背景,图2009年中国部分市前十位疾病死亡专率及死亡原因构成，数据引自“中国卫生统计年鉴2011”,背景,目前对肿瘤最有效的措施：早发现，早治疗,一.肿瘤标志物概述及试剂检测原理,1.肿瘤标志物定义：肿瘤标志物（tumormarker，TM）是指恶性肿瘤发生和发展过程中，由肿瘤细胞合成分泌或是由机体对肿瘤细胞反应而产生和（或）升高的，可预示肿瘤存在的一类物质。存在于血液、体液、细胞或组织中。参考文献：肿瘤标志物的临床应用建议中华检验医学杂志2012年2月第35卷第2期P103.,一.肿瘤标志物概述及试剂检测原理,2.肿瘤标志物临床应用,一.肿瘤标志物概述及试剂检测原理,一.肿瘤标志物概述及试剂检测原理,3.方法学原理：双抗夹心免疫学方法,一.肿瘤标志物概述及试剂检测原理,4.肿瘤标志物物试剂盒组成,一.肿瘤标志物概述及试剂检测原理,4.肿瘤标志物检测试剂盒组成,反应缓冲液（A液）：1瓶，2.5ml/瓶。PE标记混合抗体溶液（B液）：1瓶，2.5ml/瓶。校准品：6瓶，0.2ml/瓶，分别为：CAL1-CAL6。微球混悬液（C液）：1瓶，2.5ml/瓶。终止液（D液）：1瓶，15ml/瓶。AFPHOOK指示微球溶液（H液）：1瓶，250ul/瓶。（仅限含AFP指标）说明书：1份。封板纸：2张。96孔反应板：1块。光盘（读数模板+计算模板）,一.肿瘤标志物概述及试剂检测原理,5.反应过程简介,+C液25ul37反应60min,+D液100ul振荡混匀，读数，计算浓度,第二步反应,终止反应,一.肿瘤标志物概述及试剂检测原理,6.独特的抽样技术,一.肿瘤标志物概述及试剂检测原理,6.独特的抽样技术,一.肿瘤标志物概述及试剂检测原理,7.获得信号值,一.肿瘤标志物概述及试剂检测原理,8.剂量反应曲线,Y4=b4x4+a4,Y5=b5x5+a5,Y3=b3x3+a3,Y2=b2x2+a2,Y1=b1x1+a1,样本1,样本2,一.肿瘤标志物概述及试剂检测原理,核心反应原理,二、结果不一致原因分析,1.基本概念-准确度、正确度、精密度,1.准确度2.正确度3.精密度,二、结果不一致原因分析,1.基本概念-不精密度补充说明,95%置信区间,二、结果不一致原因分析,1.基本概念-灵敏度和特异度（阳性符合率、阴性符合率）,试验方法和金标准比较2*2列联,二、结果不一致原因分析,1.基本概念-相关性,二、结果不一致原因分析,1.基本概念-相关性,二、结果不一致原因分析,1.基本概念-相关性,二、结果不一致原因分析,2.不同免疫检测方法检测肿瘤标志物结果差异原因分析,（1）计量学溯源问题,上梁不正下梁歪,二、结果不一致原因分析,二、结果不一致原因分析,二、结果不一致原因分析,二、结果不一致原因分析,表目前已知肿瘤标志物有国际标准（国际约定校准）的指标,二、结果不一致原因分析,表无国际标准标志物溯源情况,二、结果不一致原因分析,二、结果不一致原因分析,图不同方法学胃蛋白酶I检测的系统误差，因为缺乏国际标准，导致系统间存在显著的差异：,二、结果不一致原因分析,（2）.类风湿因子（RheumatoidFactor,RF）干扰,类风湿因子本质是一种免疫球蛋白，可以特异性的识别自身IgG的Fc部分，属于一种自身抗体。主要存在形式为IgMRF（约占80%）及IgGRF。RF产生原因有（1）人体IgG在物理因素下其抗原性发生变化持续刺激免疫系统；（2）免疫功能紊乱；（3）遗传因素。,二、结果不一致原因分析,（2）.类风湿因子（RheumatoidFactor,RF）干扰,二、结果不一致原因分析,（3）HAAAs（HAMA）干扰(humananti-animalantibodies,HAAAs),二、结果不一致原因分析,（4）.异嗜性抗体干扰模式图,二、结果不一致原因分析,（5）.补体干扰,免疫检测系统中捕获抗体在向固相包被中和标记抗体的标记过程中,抗体分子发生变构,其Fc段的补体C1q分子结合位点被暴露出来,使C1q可以将二者连接起来,从而造成假阳性。一些公司为了增加检测的敏感性,使用链霉亲和素包被固相,将捕获抗体用亲和素标记,此过程也可引起捕获抗体的构象发生改变,造成假阳性或假阴性升高。,二、结果不一致原因分析,（6）.抗体标准化问题-CA125,二、结果不一致原因分析,（6）.抗体标准化问题-CEA,罗氏CEA说明书,二、结果不一致原因分析,（6）.抗体标准化问题-CA19-9,SoniaL.Laulu,andWilliamL.RobertsPerformanceCharacteristicsofFiveAutomatedCA19-9AssaysJ,AmJClinPathol2007;127:436-440.,二、结果不一致原因分析,（7）.钩状（Hook）效应,二、结果不一致原因分析,（7）.钩状（Hook）效应,二、结果不一致原因分析,（8）.钩状（Hook）效应,二、结果不一致原因分析,（9）.外源性污染导致的部分肿瘤标志物假阳性,唾液导致CA199、CEA假性升高。人体唾液中含CA199、CEA等抗原，因避免唾液对检测过程的污染。人体表皮皮屑、唾液、汗液导致SCCA指标假性升高。人体表皮细胞中含大量SCCA抗原，皮屑汗液等如果在实验过程中掉入到反应体系中将对SCCA产生假阳性。细菌污染导致假阳性另外细菌污染导致血清产生大量悬浮物与沉淀，在反应中导致非特异性吸附的发生，易导致假阳性。携带污染和交叉污染此类污染易出现在ELISA方法学及采用相同样品针的仪器上。,二、结果不一致原因分析,（10）室间质评样本差异,二、结果不一致原因分析,（10）室间质评样本差异,三、常见问题答疑,Q1有关肿瘤标志物Hook效应问题,无HOOK效应,弱HOOK效应,强HOOK效应,HOOK效应即钩状效应,由于抗原抗体比例不合适而导致假阴性的现象,解答：AFP在临床上有非常高的样本出现，因此我们有设置HOOK微球指示，其它项目因为我们试剂本身检测范围较广，出现HOOK的概率非常低，所以没有设置HOOK指示微球。,三、常见问题答疑,Q2有关肿瘤标志物HAMA效应问题,解答：HAMA效应是众多特异性干扰中的一种。正常人群中，约有20%的人会有或高或低的HAMA反应，因此，每家厂家的试剂都会有相应消除HAMA的成分，对于我们来说，A液主要用途就是消除HAMA等类似干扰。但和所有厂家一样，都不能保证100%的消除HAMA反应，偶尔会有个别样本出现假阳性，此类样本，需要通过稀释等手段确认。,三、常见问题答疑,Q3有关肿瘤标志物试剂盒装量的问题,解答：公司试剂盒装量一般按照110人份的量进行装量，多出来的试剂一个是为了防止枪头、粘壁等的损失，一个是弥补需要做标准品的缺点。,三、常见问题答疑,Q4有关肿瘤标志物定标频率的问题,解答：因为手工操作误差、反应温度、移液器系统误差及其它系统误差，每次试验间会有区别，造成整体信号值的变化，因此不做标准曲线会导致结果存在系统偏差。公司要求必须每次试验做标准曲线。,三、常见问题答疑,Q5有关于肿瘤标志物试剂盒组成问题,96孔板,光盘,校准品,H液,D液,C液（微球混悬液）,B液（PE标记抗体）,A液（反应缓冲液）,三、常见问题答疑,Q6有关肿瘤标志物f-PSA临床意义的问题,解答：,患良性疾病概率增加,患前列腺癌概率增加,三、常见问题答疑,Q7肿瘤标志物阳性意味着什么？,解答：TM阳性恶性肿瘤,三、常见问题答疑,Q7肿瘤标志物阳性意味着什么？,1.采血检测PSA项目前，进行直肠指检、前列腺穿刺等临床操作，PSA水平可升高；丝裂霉素、顺铂等抗肿瘤药物使PSA水平增高；2.采血检测CA125项目，受检对象处于月经期，CA125水平会增高；3.妊娠会引起AFP、freehCG、CA125水平的增高；4.吸烟人群CEA水平会有轻度升高；5.在肿瘤手术治疗、化疗和放疗过程中，由于肿瘤组织受到破坏或肿瘤坏死时某种肿瘤志物产生增加，从而影响肿瘤标志物的测定，造成假阳性6.标本放置时间过久或溶血会导致NSE水平增高7.唾液、汗液会引起SCCA、CEA、CA19-9水平增高；8.HAMA效应会造成多种肿瘤标志物假阳性；9.良性疾病会引肿瘤标志物升高，肝脏良性疾病如肝炎、肝硬化会造成AFP升高，肾衰会造成CEA水平增高等，前列腺炎会引起PSA水平增高等。,三、常见问题答疑,Q8无症状的肿瘤标志物升高的患者如何处理？,动态监测,三、常见问题答疑,Q8无症状的肿瘤标志物升高的患者如何处理？,1,3,6,月份,TM水平,0,肿瘤标志物动态监测,动态监测TM水平变化，比参考范围更有意义,cutoff,三、常见问题答疑,Q8无症状的肿瘤标志物升高的患者如何处理？,单项标志物轻度升高者，定期复查监测指标的数值变化情况，有条件的尽量复查全部的常用标志物，一旦体内有恶性肿瘤存在，可能会有几种标志物异常。如果复查后数值一直维持在参考值上限的临界水平，则意义不大。以下几类情况要特别重视：单次检查升高特别明显，数倍于正常值的上限反复检查，数值动态持续升高有家族性遗传史肿瘤筛查时肿瘤标志物增高,三、常见问题答疑,Q8无症状的肿瘤标志物升高的患者如何处理？,无症状患者伴CA19-9水平升高的临床处理原则,三、常见问题答疑,Q9肿瘤标志物阴性意味着什么？,TM阴性未患恶性肿瘤,三、常见问题答疑,Q9肿瘤标志物阴性意味着什么？,1.抗雄激素治疗前列腺疾病，会降低血清PSA水平，甚至假阴性2.钩状效应会造成肿瘤标志物水平偏低或假阴性3.标本保存不当，会造成易降解的肿瘤标志物水平偏低，甚至假阴性,4.产生肿瘤标志的肿瘤细胞数目少5.细胞或细胞表面被封闭6.机体体液中一些抗体与肿瘤标志物（肿瘤抗原）形成免疫复合物7.肿瘤组织本身血循环差，其所产生肿瘤标志物不能分泌到外周血,三、常见问题答疑,Q10肿瘤产品注册证问题,三、常见问题答疑,Q11CA125和SCCA只用于妇科肿瘤吗？,CA125是广谱肿瘤标志物，升高除可见于卵巢癌患者外，还可见于子宫内膜癌、乳房癌、胃肠道癌和其它恶性肿瘤CA125升高可见于肝炎、肝硬化、多种妇科良性疾病和妊娠早期等尽管CA125是非特异的指标，却是目前用于监测卵巢癌病人治疗效果、观察疾病发展的最重要指标，也可用于非小细胞肺癌的疗效观察及预后评估,三