第03章定量分析样品前处理.ppt

第三章定量分析样品前处理与测定方法的效能指标,第一节定量分析样品的前处理方法,一、含卤素有机药物的分析,含卤素有机药物系指药物分子结构中所含卤素直接与芳环或脂肪链相连者，而不包括某些有机药物的卤酸盐或氢卤酸盐,结构特点：CX,（一）卤原子的活泼性,1.卤原子与碳原子直接相连，卤原子的活泼性和它直接相连的烃基的结构有很大关系,（1）乙烯型卤和芳卤不活泼,（2）烯丙型卤和苄卤活泼,（3）卤代烷型介于两者之间,2.分子中所含卤原子的个数,分子中所含卤原子的个数越多，活泼性越强，特别是同一碳上含多个卤原子或一个苯环上含多个卤原子时，活泼性增强更加明显,3.卤素的种类,IBrClF,常见的含卤素有机药物,三氯叔丁醇,六氯对二甲苯,泛影酸,胆影酸,碘他拉酸,碘番酸,碘苯酯,盐酸胺碘酮,诺氟沙星,醋酸氟轻松,磺溴酞钠,（二）含卤素有机药物的分析,直接回流后测定法,碱性或酸性还原后测定法,氧瓶燃烧分解后测定法,1.直接回流后测定法,本法是将含卤素有机药物溶于适当溶剂（如乙醇）中，加入氢氧化钠溶液（或一定量过量的硝酸银滴定液）后，加热回流使其水解，将有机结合的卤素转变为无机的卤素离子，然后采用银量法（Volhard法）测定。,本法适用于含卤素有机药物结构中卤素原子结合不牢固的药物（如卤原子和脂肪碳原子相连者）。,原理三氯叔丁醇在氢氧化钠溶液中加热回流水解，氯元素全部转变成氯化钠，然后用剩余滴定法，即于水解液中加硝酸酸化，再加入定量过量的硝酸银滴定液，使Cl-生成AgCl沉淀，过量的硝酸银，以Fe3+为指示剂，用硫氰酸铵液回滴定。,例三氯叔丁醇的测定ChP（2000）,（淡棕红色）,(Ksp=1.561010),(Ksp=1.010-12),Fe3+SCNFe(SCN)2+,测定方法取本品约0.1g，精密称定，加乙醇5ml溶解后，加20%氢氧化钠溶液5ml，加热回流15min，放冷至室温，加水20ml与硝酸5ml，精密加硝酸银滴定液(0.1mol/L)30ml，再加邻苯二甲酸二丁酯5ml，密塞，强力振摇后，加硫酸铁胺指示液2ml，用硫氰酸胺滴定液(0.1mol/L)滴定，并将滴定的结果用空白试验校正。每1ml硝酸银滴定液(0.1mol/L)相当于6.216mg的C4H7Cl3O1/2H2O。,反应摩尔比为13,T滴定度，每1ml滴定液相当于被测组分的mg数c滴定液浓度，mol/LM被测物的摩尔质量，g/moln1mol样品消耗滴定液的摩尔数，常用反应摩尔比体现，即反应摩尔比为1n,2.碱性或酸性还原后测定法,本法是将含卤素有机药物在碱性或酸性下，加还原剂（如锌粉）加热回流，药物产生还原裂解反应，使有机结合的卤素转变为无机的卤素离子，然后采用银量法（Fajans法）测定。,本法适用于测定结构中碘与苯环直接相连，且一个苯环上含多个碘原子的含卤素有机药物。,（1）碱性还原后测定法,例泛影酸的测定ChP(2000),取本品约0.4g，精密称定，加氢氧化钠溶液30ml与锌粉1.0g，加热回流30min，放冷，冷凝管用少量水洗涤，滤过，烧瓶与滤器用水洗涤3次，每次15ml，洗液与滤液合并，加冰醋酸5ml与曙红钠指示液5滴，用硝酸银滴定液(0.1mol/L)滴定。每1ml硝酸银滴定液(0.1mol/L)相当于20.46mg的C11H9I3N2O4。,USP(24)、BP（1998）,ChP(2000)收载的胆影酸、碘番酸、胆影葡胺、泛影葡胺、碘他拉酸等均采用同法测定。,（2）酸性还原后测定法,取本品的干燥品约0.4g，精密称定，加锌粉1g及冰醋酸10ml，加热回流30min，放冷，冷凝管用水30ml洗涤，用脱脂棉过滤，烧瓶与脱脂棉用水洗涤2次，每次20ml，洗液与滤液合并，加四溴酚酞乙酯指示液1ml，用硝酸银滴定液(0.1mol/L)滴定。终点时黄色沉淀变为绿色。每1ml硝酸银滴定液(0.1mol/L)相当于19.031mg的C11H12I3NO2。,例碘番酸的测定JP(13),3.氧瓶燃烧分解后测定法,（1）原理,氧瓶燃烧法：将有机药物放入充满氧气的密闭燃烧瓶中进行燃烧，并将燃烧所产生的欲测物质吸收于适当的吸收液中，然后根据欲测物质的性质，采用适宜的分析方法进行鉴别、检查或含量测定,适用于含卤素、硫、氮、硒等有机药物的分析,本法特点是简便、快速、破坏完全，尤其适用于微量样品的分析,（2）仪器与材料,仪器装置燃烧瓶为500、1000或2000ml无色、磨口、厚壁、硬质玻璃锥型瓶；瓶塞空心，底部熔封铂丝一根，下端呈螺旋状或网状,称样用材料及称样A.固体样品无灰滤纸B.液体样品纸袋,C.软膏类样品：将适量样品置不含被测成分的蜡油纸中包裹严密，外层再用无灰滤纸包裹,吸收液,A.作用：吸收液的作用是将样品经燃烧分解所产生的各种价态的卤素、硫、氮、硒等，定量地吸收并转变为一定的便于测定的价态,氧气,B.吸收液的选择,氟水氯NaOH溶液溴H2O2-NaOHNaOH-硫酸肼饱和溶液碘NaOH硫酸肼饱和溶液硫NaOH或H2O2硒硝酸溶液,（3）操作方法,燃烧瓶燃烧前的准备用洗液洗净后，按各药品项下的规定加入吸收液，将瓶口用水湿润，小心急速地通入氧气1min，立即用表面皿覆盖瓶口。样品的准备取样品适量，精密称定后按规定方法包裹，固定于铂丝下端的网内或螺旋处。,样品的燃烧点燃包有供试品的滤纸尾部，迅速放入燃烧瓶中，按紧瓶塞，加水少量封闭瓶口，俟燃烧完毕（应无黑色碎片），充分振摇，使生成的烟雾完全吸入吸收液中，放置15min，用水少量冲洗瓶塞及铂丝，合并洗液及吸收液，同法另做空白试验。然后按各药品项下规定的方法进行鉴别、检查或含量测定。,根据被燃烧分解的样品量选用适宜大小的燃烧瓶。,（4）注意事项,ChP（2000）规定的燃烧瓶体积为500、1000或2000ml三种，采用常量或半微量分析,正确选用燃烧瓶的目的在于：样品能在足够的氧气中燃烧分解完全；有利于将燃烧分解产物较快地吸收到吸收液中；防止爆炸的可能性。,测定含氟有机药物时，用石英制燃烧瓶,铂丝燃烧时起催化作用,应同时做空白试验,燃烧时要注意防爆,燃烧要完全,燃烧产生的烟雾完全被吸收,（5）应用,例磺溴酞钠的含量测定ChP(2000),溴取本品约0.2g，照氧瓶燃烧法（附录C）进行有机破坏，选用1000ml燃烧瓶，以0.4%氢氧化钠溶液10ml，浓过氧化氢溶液0.5ml与水10ml作为吸收液，俟生成的烟雾完全吸入吸收液后，用水稀释至100ml，煮沸5分钟，放冷，加稀硝酸使成酸性，精密加硝酸银滴定液（0.1mol/l）20ml，摇匀，再加硫酸铁胺指示液2mL，用硫氰酸胺滴定液(0.1mol/L)滴定，并将滴定的结果用空白试验校正。每1mL硝酸银滴定液(0.1mol/L)相当于7.990mg的溴(Br)。,例碘苯酯的含量测定ChP（2000）,原理碘苯酯系有机碘化物，用氧瓶燃烧分解，转变为碘化物，继而氧化为游离的碘，并被定量地吸收于吸收液中，和氢氧化钠反应，生成碘化物与碘酸盐，加入溴-醋酸溶液，使全部转变为碘酸盐，过量的溴以甲酸及通空气去除。加入碘化钾，使与碘酸盐反应析出游离碘，用硫代硫酸钠液滴定，碘与淀粉结合所显的蓝色消失即为终点,取本品约20mg，精密称定，照氧瓶燃烧法进行有机破坏，用氢氧化钠试液2ml与水l0ml为吸收液，待吸收完全后，加溴醋酸溶液(取醋酸钾10g，加冰醋酸适量使溶解，加溴0.4ml，再加冰醋酸使成1000m1)l0ml，密塞，振摇，放置数分钟，加甲酸约lml，用水洗涤瓶口，并通入空气流约35min以除去剩余的溴蒸气，加碘化钾2g，密塞，摇匀，用硫代硫酸钠滴定液(0.02Mol/L)滴定，至近终点时，加淀粉指示液，继续滴定至蓝色消失，并将滴定的结果用空白试验校正。每lml的硫代硫酸钠滴定液(0.02mol/L)相当于1.388mg的C19H29IO2。,滴定度的计算放大反应,2mol碘苯酯1molI21molI21molNaIO+1molNaI1molNaIO1/3molNaIO3+2/3molNaI,即2mol碘苯酯2molNaIO3,2molNaIO3+10I-6molI2,即2mol碘苯酯1molI26molI212molI12molNa2S2O3,反应摩尔比为16,98：140.氧瓶燃烧法中的装置有A.磨口硬质玻璃锥形瓶B.磨口软质玻璃锥形瓶C.铂丝D.铁丝E.铝丝,96：133（99x：138）选择氧瓶燃烧法所必备的实验物品A.磨口硬质玻璃锥形瓶B.铂丝C.普通滤纸D.氢气E.无灰滤纸,99：76氧瓶燃烧法测定含氯有机药物时所用的吸收液多数为A.H2O2溶液B.H2O2NaOH溶液C.NaOH溶液D硫酸肼饱和液E.NaOH硫酸肼饱和液,99：134.氧瓶燃烧法可用于A.含卤素有机药物的含量测定B.醚类药物的含量测定C.检查甾体激素类药物中的氟D.检查甾体激素类药物中的硒E.芳酸类药物的含量测定,二、含金属有机药物的分析,含金属的有机药物：金属原子不与碳原子直接相连，通常为有机酸及酚的金属盐或配位化合物如酒石酸锑钾、葡萄糖酸锑钠、富马酸亚铁,有机金属药物：金属原子直接与碳原子以共价键相连，结合比较牢固如卡巴胂、醋酸苯汞、汞撒利,酒石酸锑钾,硬脂酸镁,富马酸亚铁,葡萄糖酸锑钠,卡巴胂,醋酸苯汞,汞撒利,含金属有机药物定量分析前的处理方法,不经有机破坏的分析方法直接测定法;经水解后测定法;经还原-汞齐化后测定法经有机破坏的分析方法湿法破坏(硝酸-高氯酸法;硝酸-硫酸法;硫酸-硫酸盐法等);干法破坏,（一）不经有机破坏的分析方法,1.直接测定法,适用于金属原子不直接与碳原子相连的含金属有机药物或某些CM键结合不牢固的有机金属药物。,富马酸亚铁的含量测定ChP(2000),取本品约0.3g，精密称定，加稀硫酸15ml，加热溶解后，放冷，加新沸过的冷水50ml与邻二氮菲指示液2滴，立即用硫酸铈滴定液(0.1mol/L)滴定，并将滴定的结果用空白试验校正。每1ml硫酸铈滴定液(0.1mol/L)相当于16.99mg。,原理,Fe2+Ce4+Ce3+Fe2+,例葡萄糖酸锑钠的测定ChP（2000）取本品约0.3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加水100ml、盐酸15ml与碘化钾试液10ml，密塞、振摇后，在暗处静置10min，用硫代硫酸钠滴定液(0.1mol/L)滴定，至近终点时，加淀粉指示液，继续滴定至蓝色消失，并将滴定的结果用空白试验校正。每lml的硫代硫酸钠滴定液(0.1mol/L)相当于6.088mg的Sb。,如枸橼酸铁铵的测定ChP（2000）取本品约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中。加水15ml溶解后，加硫酸lml，加热至溶液由暗棕色变成淡黄色，放冷至约15，滴加高锰酸钾试液至溶液显粉红色并持续5s，加盐酸15ml与碘化钾试液15ml，密塞，静置3min，加水50ml稀释后，用硫代硫酸钠滴定液(0.1mol/L)滴定至近终点时，加淀粉指示液2ml，继续滴定至蓝色消失，并将滴定的结果用空白试验校正。每lml的硫代硫酸钠滴定液(0.1mol/L)相当于5.585mg的Fe。,2.用硫酸水解后测定法,例硬脂酸镁的测定ChP（2000）,取本品约0.1g，精密称定，精密加硫酸滴定液(0.05mol/L)50ml，煮沸至油滴澄清，继续加热10min，放冷至室温，加甲基橙指示液12滴，用氢氧化钠滴定液(0.1mol/L)滴定。每1ml硫酸滴定液(0.05mol/L)相当于2.016mg的MgO。,原理：,某些含汞有机药物，由于CHg键不牢固，在水溶液（冰浴）中滴加硫酸使其水解，将有机汞定量转化成硫酸汞，再用硫氰酸铵滴定液滴定。,例汞撒利的测定,取本品约0.5g，精密称定，加蒸馏水10ml，置冰浴中，滴加硫酸10ml，随滴随搅拌，至产生的沉淀复溶解，再加蒸馏水50ml，硫酸铁铵指示液2ml，用硫氰酸铵滴定液(0.1mol/L)滴定。每1ml硫氰酸铵滴定液(0.1mol/L)相当于25.29mg的汞撒利。,3.经还原-汞齐化后测定法,本法系在酸性或碱性溶液中，加锌粉、加热回流，将药物中有机结合的汞还原析出金属汞，并与过量的锌生成锌汞齐。将锌汞齐溶于硝酸后，选用适当的方法测定汞的含量，并换算成含汞有机药物的含量。,如醋酸苯汞的含量测定取本品约0.5g，精密称定，置100ml烧瓶中，加水15ml，甲酸5ml与锌粉1g，附回流冷凝器，煮沸30min。放冷，滤过，滤纸和锌汞齐用蒸馏水洗涤至洗液对石蕊试纸不显酸性反应。将锌汞齐溶解在稀硝酸(12)40ml中，置蒸气浴上加热3min，加尿素0.5g和足够的高锰酸钾试液至显桃红色。冷却后，加过氧化氢溶液脱色，加硫酸铁铵指示剂lml，用硫氰酸铵滴定液(0.1mol/L)滴定，即得。每1ml硫氰酸铵液(0.1mol/1)相当于16.84mg的C8H8O2Hg。,（二）经有机破坏的分析方法,适用于金属原子与碳原子结合牢固的有机金属药物。,1.湿法破坏（1）硝酸-高氯酸法本法适用于血、尿、组织等生物样品的破坏，有机金属药物经破坏后，得到的无机金属离子一般呈高价态。本法不能用于含氮杂环药物的破坏,（2）硝酸-硫酸法本法适用于大多数有机物质的破坏，破坏得到的无机金属离子均为高价态。本法不能用于含碱土金属有机药物的破坏,（3）硫酸-硫酸盐法本法是往样品中加入浓硫酸作氧化剂，加入硫酸盐提高硫酸的沸点，增强硫酸的氧化破坏能力，且防止硫酸的分解损失。本法常用于含砷或锑有机药物的破坏，破坏得到的无机金属离子多为低价态。,（4）其它湿法硝酸硫酸高氯酸法硫酸氧化剂法（过氧化氢法、高锰酸钾）破坏后，金属呈高价态,2.干法破坏,适用于湿法不易破坏完全的有机物以及某些不能用硫酸进行破坏的有机药物。不适用于含易挥发性金属（如汞、砷等）有机药物的破坏,注意事项：（1）加热或灼烧时，应控制温度在420以下（2）一定要灰化完全（3）经本法破坏后，所得灰分往往不易溶解，但不要轻易弃去,第二节药品质量标准分析方法验证,一、目的,证明所采用的分析方法适合于相应的检测要求，方法验证过程和结果均应记载在药品标准起草和修订说明中。,二、用途,（一）药品质量标准起草时，分析方法需经验证。,（二）药物合成方法变更、制剂的组分变更、原分析方法进行修订时，分析方法需经验证。,三、需验证的分析项目,1.鉴别试验；2.杂质定量或限度检查；3.原料或制剂中有效成分含量测定；4.制剂中其它成分（降解产物、防腐剂等）的测定；5.溶出度、释放度等功能检查中的溶出量等的测试方法。,验证内容有：准确度、精密度（重复性、中间精密度和重现性）、专属性、检测限、定量限、线性、范围和耐用性,四、验证内容,（一）准确度（accuracy）准确度是指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度，用百分回收率表示。,测定回收率R（recovery）的具体方法可采用“回收试验法”和“加样回收试验法”。,回收试验空白+已知量A的对照品（或标准品）测定，测定值为M,加样回收试验已准确测定药物含量P的真实样品+已知量A的对照品（或标准品）测定，测定值为M,数据要求规定的范围内，至少用9次测定结果评价，如制备三个不同浓度样品各测三次。,1.含量测定方法的准确度,原料药可用已知纯度的对照品或样品进行测定，或用本法所得结果与已建立准确度的另一方法测定的结果进行比较。,制剂可用含己知量被测物的各组分混合物进行测定，即采用在空白辅料中加入原料药对照品的方法。如不能得到制剂的全部组分，可向制剂中加入已知量的被测物进行测定，或与另一个已建立准确度的方法比较结果。,中药分析的准确度一般用加样回收试验衡量。中药回收率一般要求在95105%范围内，有些方法操作步骤繁多时，可要求在90110%范围内。RSD一般在3%以内。,2杂质定量测定的准确度可向原料药或制剂中加入已知量杂质进行测定。如果不能得到杂质或降解产物，可用本法测定结果与另一成熟的方法进行比较。,（二）精密度（precision）精密度是指在规定条件下，同一个均匀样品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度。用偏差（d）、标准偏差(SD)、相对标准偏差(RSD)（变异系数，CV）表示。,偏差（d）：测量值与平均值之差,标准（偏）差（SD或S）,相对标准（偏）差（RSD），也称变异系数（CV）,1.重复性在相同条件下，由同一个分析人员测定所得结果的精密度；在规定的范围内，至少用9次测定结果评价，如制备三个不同浓度样品各测三次或把被测物浓度当作100%，至少测6次进行评价。,2.中间精密度同一实验室，不同时间由不同分析人员用不同设备所得结果的精密度。考察随机变动因素的影响。变动因素为不同日期、不同分析人员、不同设备,3.重现性不同实验室，不同分析人员测定结果的精密度。当分析方法将被法定标准采用时，应进行重现性试验。如建立药典分析方法时通过协同检验得出重现性结果，协同检验的过程、重现性结果均应记载在起草说明中。,（三）检测限（limitofdetection，LOD）检测限系指试样中被测物能被检测出的最低量。是限度试验参数，无需定量测定。常用%、ppm、ppb表示。,1非仪器分析目视法用已知浓度的被测物，试验出能被可靠地检测出的最低浓度或量。,2信噪比法用于能显示基线噪音的分析方法（仪器分析方法），是把已知低浓度试样测出的信号与空白样品测出的信号进行比较，算出能被可靠地检测出的最低浓度或量。一般以信噪比（S/N）31或21时的相应浓度或注入仪器的量确定检测限。,3数据要求应附测试图谱，说明测试过程和检测限结果。,（四）定量限（1imitofquantitation，LOQ）指样品中被测物能被定量测定的最低量，结果应具有一定准确度和精密度。常用%、ppm、ppb表示。,常用信噪比法确定定量限，一般以信噪比（S/N）为101时相应的浓度或注入仪器的量进行确定，也可用仪器所测空白背景响应标准差（SD）的10倍为估计值，再经试验确定。,（五）专属性（specificity）指有其他成分（杂质、降解物、辅料等）可能存在情况下采用的方法能准确测定出被测物的特性，能反映该方法在有共存物时对供试物准确而专属的测定能力。是指该法用于复杂样品分析时相互干扰程度的度量。,（六）线性在设计的范围内，测试结果与试样中被测物浓度直接呈正比关系的程度。数据要求：应列出回归方程、相关系数和线性图。,（七）范围指达到一定精密度、准确度和线性的条件下，测试方法适用的高低限浓度或量的区间。,（八）耐用性指测定条件稍有变动时，结果不受影响的承受程度，为常规检验提供依据。是衡量实验室和工作人员之间在正常情况下实验结果重现性的尺度。,（九）应用1.鉴别试验除专属性、耐用性外，其它都不要求。,2.杂质的限量检查除专属性、检测限、耐用性外，其它都不要求。杂质的定量测定除检测限外，其它都要求。,3.含量测定及溶出量测定除检测限、定量限外，其它都要求。,（十）各种含量测定方法对效能指标的要求1.容量分析法：用原料药精制品(含量99.5)或对照品考察方法的精密度，相对标准差一般应不大于0.2；进行回收率试验。回收率一般在99.7100.3之间。,2.UV法：用适当浓度的精制品进行测定，其RSD一般不大于1。制剂的测定，回收率一般应在98102之间。,线性：吸光度A一般在0.20.7，浓度点n5。用浓度c对A作线性回归处理，得一直线方程，r应大于0.999(n5)，方程的截距应近于零。,3.HPLC法：要求RSD2，回收率98102之间。线性范围：用精制品配制一系列标准溶液，浓度点n应为57，用浓度c对峰高h或被测物的响应值之比进行回归处理，建立回归方程，r应大于0.999，截距应趋于零。,专属性：要考查辅料、有关物质或降解产物对主药的色谱峰是否有干扰，如有干扰应设法排除,99：73.精密度是指（B）A.测得的测量值与真值接近的程度B.测得的一组测量值彼此符合的程度C.表示该法测量的正确性D.在各种正常试验条件下，对同一样品分析所得结果的准确程度E.对供试物准确而专属的测定能力,99x：76精密度是指该法（D）A.测得的测量值与真值接近的程度B.测得的测量值与回收率接近的程度C.测量的正确性D.测得的一组测量值彼此符合的程度E.对供试物准确而专属的测定能力,9