第五章 酶与细胞的固定化.ppt

第五章酶与细胞的固定化,一、酶与细胞的固定化二、固定化酶和固定化细胞的性质与表征三、固定化酶和固定化细胞的应用,第五章酶与细胞的固定化,一、酶与细胞的固定化酶作为工业催化剂存在的缺陷：1）稳定性差2）分离纯化困难3）回收困难,（一）固定化酶和固定化细胞的定义1、固定化酶固定化酶(immobilizedenzyme)概念：P220优缺点：P2202、固定化细胞概念：P221优缺点：P221,水溶性酶,水不溶性载体,固定化技术,水不溶性酶（固定化酶）,什么是固定化酶？,柱式酶反应器工作原理示意图,（二）酶和细胞固定化方法1、酶的固定化（1）一般方法及特点关键在于选择适当的固定化方法和必要的载体以及稳定性研究、改进。1）三大类方法（或四大类方法）：载体结合法吸附法（包括电吸附法）、结合法（无机多孔材料）交联法（双功能试剂）包埋法（微胶囊法）,2）选择方法依据：a、酶的性质。b、载体的性质。c、制备方法的选择。3）固定化后酶的考察项目：a、测定固定化酶的活力，以确定固定化过程的活力回收率。b、考察固定化酶稳定性。c、考察固定化酶最适反应条件。,（2）酶的固定化方法1）载体结合法概念：P222a、物理吸附法利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在载体表面上。选择载体的原则:（a）要有巨大的比表面积;（b）要有活泼的表面;（c）便于装柱进行连续反应。常见载体有无机载体（高岭土、硅胶、氧化铝、多孔玻璃、活性碳、羟基磷灰石等），有机载体（纤维素、胶原、大孔合成树脂、陶瓷、海藻酸钠CA等）。相对于有机载体，无机载体材料大多成本低、使用寿命长、机械强度高和耐酸碱等特性而更具实用性。b、离子结合法也称离子交换吸附法。常见载体有阴离子交换剂（DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等），阳离子交换剂（CM-纤维素等）。使用中必须注意：pH、离子强度、温度。c、共价结合法可以形成共价键的基团：游离氨基、游离羧基、巯基、咪唑基、酚基、羟基、甲硫基、吲哚基和二硫键等。常见载体有天然高分子衍生物（纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖等），人工合成的高聚物（聚丙烯酰胺PAM、聚苯乙烯、聚乙烯醇PVA、尼龙等），无机载体（多孔玻璃等）。,酶和细胞固定化模式图,c、共价结合法载体活化的方法有重氮法、叠氮法、烷基化反应法、硅烷化法、溴化氰法等。重氮法目前在我们国内用的较多的载体是对氨基苯磺酰乙基（ABSE）纤维素、琼脂糖，葡聚糖凝胶和琼脂等。该方法需要载体具有芳香族氨基。,叠氮法对含有羧基的载体，与肼基作用生成含有酰肼基团的载体，再与亚硝酸活化，生成叠氮化合物。最后与酶偶联。包括酯化、肼解、叠氮化、偶联等步骤。,烷基化反应法含羟基的载体可用三氯三嗪等多卤代物进行活化，形成含有卤素基团的活化载体。,硅烷化法常用的载体：多孔玻璃，多孔陶瓷。多孔玻璃特点：机械强度好，表面积大。耐有机溶剂和微生物破坏。载体可以再生，寿命长等。,溴化氰法本方法主要用溴化氰（CNBr）活化多糖类物质。如纤维素、葡聚糖、琼脂糖等，其中以琼脂糖为载体的占多数（大孔网状结构）。用溴化氰法活化琼脂糖制备得到的固定化酶目前使用很广，特别用作亲和层析，有着良好的性能。,2）交联法借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法称为交联法。也可用于含酶菌体或菌体碎片的固定化。常见的功能团：N末端氨基、Lys氨基、Tyr酚基、Cys巯基、His咪唑基等。常用试剂：戊二醛、异氰酸酯、N，N乙烯马来亚胺、双重氮联苯胺等。应用最广泛的是戊二醛，它两个醛基都可以与酶或蛋白质的游离氨基形成席夫碱(shiff)。交联法有2种形式即酶直接交联法和酶辅助蛋白交联法。酶直接交联法：在酶液中加入适量多功能试剂，使其形成不溶性衍生物。固定化依赖酶与试剂的浓度、溶液pH和离子强度、温度和反应时间之间的平衡。酶辅助蛋白交联法：为避免分子内交联和在交联过程中因化学修饰而引起酶失活，可使用第二个载体蛋白质（即辅助蛋白质，如白蛋白、明胶、血红蛋白等）来增加蛋白质浓度，使酶与惰性蛋白质共交联。分子内交联：多数发生于低的酶浓度，交联后酶通常仍保持溶解状态。分子间交联：发生于较高酶浓度下，交联后酶通常保持不溶解状态。,3）包埋法将聚合物的单体和酶溶液混合后，借助聚合促进剂（如交联剂）的作用使单体进行聚合，从而将酶包埋于聚合物中的固定化方法。网格型包埋法：将酶或含酶菌体包埋在凝胶细微网格中，制成一定形状的固定化酶，称为网格型包埋法。也称为凝胶包埋法。聚丙烯酰胺凝胶（PAM）、聚乙烯醇（PVA）以及天然高分子化合物等。微囊型包埋法：是将酶包埋在各种高分子聚合物制成的小球内，制成固定化酶。由于固定化形成的酶小球直径一般只有几微米至几百微米，所以也称为微囊化法。,网格型包埋法,微囊型包埋法,（3）各种固定化酶方法的优缺点比较表5.1酶的各种固定化方法的比较,举例海藻酸钙包埋法称取一定量的海藻酸钠配成水溶液，经杀菌冷却后，与一定体积的酶液混合均匀，然后用注射器或滴管将冷悬液滴入一定浓度的凝固浴中（常用CaCl2溶液），形成球状固定化酶。明胶作载体，戊二醛作交联剂制备固定化果胶酯酶15明胶溶液100mI加入1mI酶液。搅拌均匀后，加入5浓度的戊二醛10mI，充分搅拌，凝固后置4冰箱保存4h，取出切成约3cm2见方的小方块，用0.5浓度的戊二醛溶液浸泡16h，取出用蒸馏水洗涤数次。,2、固定化细胞,（1）概念：固定在载体上并在一定的空间范围内进行生命活动的细胞称为固定化细胞.该细胞能进行正常的生长、繁殖和新陈代谢，又称固定化活细胞或固定化增殖细胞。（2）细胞固定化方法：吸附法、包埋法。1）吸附法：主要通过载体与细胞间的静电引力，即细胞表面与载体之间范德华作用力、离子键和氢键作用力，使细胞固定在载体上。2）包埋法：在细胞自身并不与凝胶基体发生化学键合的情况下将其包埋在半透性聚合物颗粒（或膜）内的一种固定化方法。包埋法的最大优点是能较好的保持细胞内多酶系统的活力，可象游离细胞那样进行产物的发酵生产。常用载体：琼脂、海藻酸钙、角叉菜胶、明胶、聚丙烯酰胺。常用凝胶包埋法。,二、固定化酶和固定化细胞的性质与表征（一）固定化酶的性质1、酶的活性多数情况下固定化酶的活力常低于天然酶。原因：酶结构变化与空间位阻。2、酶的稳定性大多数固定化酶具有较高的稳定性、较长的操作寿命和保存寿命。表现：1）增加酶的耐热性2）增大了酶对变性剂、抑制剂的抵抗能力3）减轻了蛋白酶的破坏作用4）增强贮存的稳定性和操作的稳定性原因：a.固定化后酶分子与载体多点连接。b.酶活力的释放是缓慢的。c.抑制自降解，提高了酶稳定性。3、酶的最适温度一般与游离酶差不多，但有些会有较明显的变化。4、酶的最适pH带负电荷载体（DEAE-纤维素等阴离子聚合物）制备的固定化酶，最适pH较自然酶偏高；带正电荷载体（CM-纤维素等阳离子聚合物）制备的固定化酶，最适pH较自然酶偏低。,采用明胶作载体,戊二醛作交联剂制备固定化果胶酯酶（焦云鹏，2005）,固定化果胶酯酶的热稳定性,固定化果胶酯酶的pH稳定性,固定化果胶酯酶作用的最适pH值,采用明胶作载体,戊二醛作交联剂制备固定化果胶酯酶（焦云鹏，2005）,固定化果胶酯酶作用的最适温度,5、酶的动力学特征固定化酶的表观米氏常数Km随载体的带电性能变化。二者电荷不同，因静电作用，固定化酶的表观Km值低于溶液的Km值；电荷相同，由于亲和力降低，固定化酶的表观Km值显著增加。6、酶的作用专一性（二）固定化酶的评价指标1、酶活力（1）酶活定义（IU)：在特定条件下，每一分钟催化一个微摩尔底物转化为产物的酶量定义为1个酶活单位。1Kat=1mol/s=60mol/min=60*106umol/min=6*106IU（2）固定化酶的比活：每（克）干固定化酶所具有的酶活力单位。或：单位面积（cm2）的酶活力单位表示（酶膜、酶管、酶板）。2、蛋白总量BCA法、考马斯亮蓝法等。,3、4、偶联率及相对活力相对酶活力：具有相同酶蛋白（或RNA）量的固定化酶活力与游离酶活力的比值称为相对酶活力5、半衰期（t1/2）衡量稳定性的指标。连续测活条件下固定化酶活力下降为最初活力一半所需要的时间（t1/2）,三、固定化酶和固定化细胞的应用（一）基础研究中的作用（二）工农业生产中的应用1、固定化木瓜蛋白酶改善啤酒品质2、固定化青霉酰化酶合成6-APA、7-ACA等。通过改变pH值等条件，可以生成不同的产物。3、固定化细胞生产L-苹果酸4、其他：葡萄糖异构酶世界上生产规模最大的一种固定化酶。利用固定化乳糖酶可以连续生产低乳糖奶。固定化酵母细胞等微生物可用于生产各种酒类。热点：固定化原生质体的应用。（三）固定化酶在医药上的应用1、可溶性载体修饰用于包埋和修饰药物酶的可溶性载体有：多糖或糖肽、聚乙二醇、吡咯烷酮等。2、凝胶包埋3、脂质体包埋磷脂双分子层能在水溶液中自发形成超微型中空小泡，具备双重亲和性，具有很好的生物相容性和可生物降解性，无毒，无免疫原性。,青霉素酰化酶催化合成头孢类抗生素,7-ACAasnucleus,7-ACCAor7-ADCAasnucleus,酶促合成头孢类抗生素,-Reversiblereaction-Hydrolysisofsubstrateorproductbybiocatalyst-Difficultyofseparationofproductfromreactants,（四）固定化酶在分析检测中的应用1、酶传感器和酶柱检测器酶柱和酶管，可与分光光度计、荧光计或电量计结合，形成酶电极，进行某些物质的自动分析。酶电极特点：快速、方便、灵敏、精确范围：糖类、抗生素、氨基酸、甾体化合物、有机酸、脂粉、醇类、胺类以及尿素、尿酸、硝酸、磷酸等要求：酶必须有较强的专一性，并且要有一定的纯度。,酶电极,2、酶联免疫测定基本原理：常用的酶：过氧化氢酶、碱性磷酸酶酶标与过氧化氢反应氧电极测定酶活抗原（体）量酶标与硝基酚磷酸反应420nm分光光度计测定酶活抗原（体）量3、其他,（五）固定化微生物技术在废水处理中的应用,思考题,酶作为工业催化剂存在哪些缺陷？你是如何认识的？什么是固定化酶、固定化细胞？目前生产量最大的固定化酶是什么？它催化什么反应？固定化酶最早成功的例子是什么？它催化什么反应？医药上生产量最大的固定化酶是什么？它催化什么反应？固定化酶、固定化细胞各有什么优缺点？什么是载体结合法？有几种类型？什么是共价结合法？有几种类型？共价结合中如何实现载体酶的偶联？常用的偶联反应有哪些？什么是固定化酶的相对酶活力？哪些