第十章 分子生物学技术6.ppt

第六章分子生物学技术,生化技术电泳层析离心分光光度基因操作其它,电泳层析离心分光光度基因操作其它分（离目的基因）切（割目的基因和载体）接（连目的基因和载体）转（化宿主细胞）筛（选阳性克隆）表（达目的基因）,基本模式,“纵向”体系,“横向”体系,第一节核酸及蛋白质操作技术,DNA操作技术RNA操作技术蛋白质操作技术,DNA操作技术,DNA的分离DNA的纯化DNA的鉴定DNA的扩增及基因文库的构建,RNA操作技术,RNA的分离RNA的纯化RNA的鉴定cDNA的扩增及cDNA文库构建,一、核酸操作技术,（一）核酸的分离与纯化,基本原则：1、保证一级结构的完整性，完整的一级结构是研究核酸结构和功能的基础；2、排除蛋白质、脂类、糖类等其他分子的污染。,核酸提取的主要步骤,来源：细胞（包括培养细胞）、病毒温和裂解，溶解核酸，使核酸与蛋白（组蛋白）分离；采用化学或酶学方法去除蛋白质、DNA/RNA及其他大分子。,生物样本（细胞、病毒）破碎分离纯化质量测定保存,核酸的贮存,核酸分离提取的基本步骤,Step1,Step2,Step3,Step4,细胞的破碎：物理方法溶胀和自溶化学方法生物酶降解,核酸的纯化,核酸的浓缩和沉淀,抑制RNase活性是提取RNA的关键,在实验中，严格控制内源性和外源性RNase的污染。RNase可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等。外源性RNase存在于操作人员的手汗、唾液等，也可存在于灰尘中。在其它分子生物学实验中使用的RNase也会造成污染。这些外源性的RNase可污染器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各种试剂。各种组织和细胞中则含有大量内源性的RNase。RNA操作中的要求,防止RNA酶污染的措施,1.所有的玻璃器皿均应在使用前于180的高温下干烤6hr或更长时间。2.塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用）。3.有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3%H2O2室温10min，然后用0.1%DEPC水冲洗，晾干。4.配制的溶液应尽可能的用0.1%DEPC，在37处理12hr以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22m滤膜过滤除菌。5.操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。6.设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。,常用的RNA酶抑制剂,1.焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。高温条件下分解。2.异硫氰酸胍：目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。3.氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。4.RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNA酶结合，使其失活。5.其它：SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。,RNA的分离和纯化-TRIzol试剂法,原理：首先用含有异硫氰酸胍和酚的一种单相液来裂解细胞，加入氯仿产生第二相，离心后，RNA存在于水相。经异丙醇沉淀水相中的RNA可用于Northern杂交分析、RT-PCR等；存在于有机相的DNA和蛋白质用乙醇和异丙醇连续沉淀而分别分离，得到的DNA大小约20Kb，适用于PCR的模板；回收的蛋白质主要用于免疫印迹分析。,（二）、核酸的鉴定1、核酸分子杂交鉴定,（1）核酸分子杂交的基本原理（见第二章）,（2）影响杂交的因素a.核酸分子的浓度和长度：浓度越大，复性速度越快分子越大，复性速度越慢单链探针，浓度增加，杂交效率增加双链探针，浓度控制在0.10.5g,浓度过高影响杂交效率,b.温度：DNA/DNA杂交，适宜温度较Tm值低2025RNA/DNA或RNA/RNA杂交，加甲酰胺降低Tm值用寡核苷酸探针杂交，适宜温度较Tm值低5,c.离子强度：低盐浓度时杂交率较低，随着盐浓度增加，杂交率增加高浓度的盐使碱基错配的杂交体更稳定，当进行序列不完全同源的核酸分子杂交时，必须维持杂交反应液中较高的盐浓度和洗膜溶液的盐浓度,d.甲酰胺：甲酰胺能降低核酸杂交的Tm值，能降低杂交液的温度，低温时探针与待测核酸杂交更稳定，当待测核酸与探针同源性不高时，加50%甲酰胺溶液在3542杂交如待测核酸序列与探针同源性高时，则用水溶液在68杂交,e.核酸分子的复杂性：核酸的复杂性是指存在于反应体系中不同顺序的总长度Cot与反应体系中核酸复杂性成正比两个DNA样品浓度绝对一致时，变性后的相对杂交率取决于DNA的相对复杂性,f.非特异性杂交反应：杂交前封闭非特异性杂交位点，减少其对探针的非特异性吸附常用的封闭物有两类：即非特异性DNA和高分子化合物。如鲑精DNA或小牛胸腺DNA，Denharts溶液或脱脂奶粉,（3)、核酸分子杂交的方法按待测核酸是否固定在固相支持物上分：固-液相杂交膜上印迹杂交原位杂交液相杂交RNA酶保护分析法核酸酶S1保护分析法,斑点及狭缝印迹杂交斑点印迹为圆形狭缝印迹为线状鉴别DNA、RNA简单、快速，同一张膜可检测多个样品特异性不高、不能鉴别核酸分子量,固液杂交膜上印迹杂交,Southern和Northern杂交（略）,原位杂交定义：将标记的核酸探针与固定在细胞或组织中的核酸进行杂交，称原位杂交。根据检测物分细胞内原位杂交和组织切片内原位杂交；根据探针与待检核酸分：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA杂交,固液杂交,保持组织细胞的形态对核酸无抽提，修饰与降解作用不改变核酸在组织细胞内的定位不阻碍核酸与探针的杂交过程对杂交信号无遮蔽作用理化性质稳定,杂交过程：（1）组织或细胞的固定理想固定液应具备：,（2）组织细胞杂交前的预处理,去垢剂（如Tritonx-100和SDS）和蛋白酶K去除核酸表面的蛋白质组织细胞内的核酸与蛋白质结合成核酸蛋白复合体控制消化时间，避免细胞结构破坏和核酸从载玻片上脱落,（3）探针的选择与标记,以获得最好杂交效果为依据选择探针探针的长度一般为50300bp,有时达1.5kb放射性核素标记探针敏感性高，操作简便稳定检测结果分辨率高，但信号检测时间长非核素标记探针安全、稳定性好、显色快，易于观察,（4）杂交,杂交液体积小：1020lcDNA和RNA探针杂交温度约为50杂交时间:DNA探针杂交为24h.RNA探针杂交过夜杂交前一般将组织切片置95515分钟使DNA变性冲洗温度一般不超过50,（5）杂交结果检测,所用探针为核素标记,放射自显影检测所用探针为非核素标记,比色或化学发光检测,检测目标菌落的杂交技术,菌落杂交,原位杂交,液相杂交指待测核酸和探针都存在于杂交液中，碱基互补的单链核酸分子在液体中配对形成杂交分子的过程。,A、RNA酶保护分析法,a.RNA酶保护分析法原理RNaseA和RNaseT1专一水解杂交体系中的单链RNA，不水解探针RNA与待测RNA互补形成的双链RNA，使杂交分子得到保护，称RNA酶保护分析法。,b.杂交过程,制备待测RNARNA探针的制备与标记：体外转录法制备和标记RNA探针杂交：待测RNA与RNA探针在液相中杂交RNaseA和RNaseTI除去单链RNA电泳分离RNA放射自显性检测杂交结果,B、核酸酶S1保护分析法a.原理核酸酶S1在一定条件下专一水解杂交体系中的单链DNA和单链RNA，不水解DNA探针与待测RNA杂交形成的杂交体，使杂交分子得到保护，称核酸酶S1保护分析法,b.杂交过程,制备待测RNA：总RNA或mRNA均可单链DNA探针的制备与标记杂交：单链DNA探针与待测RNA在液相中杂交核酸酶S1除去单链DNA和单链RNA电泳分离DNA/RNA杂交体分子放射自显影检测杂交结果,（4）探针的标记,a.探针的种类,核酸探针根据标记方法不同可粗分为放射性探针和非放射性探针两大类；非放射性的探针又分为荧光探针、DNA半抗原标记探针、光敏生物素标记探针以及酶标记的探针（要结合底物显色）等；根据探针的核酸性质不同又可分为DNA探针、RNA探针、cDNA探针及寡核苷酸探针等几类。,b.标记物理想标记物应具备以下特性：,高度灵敏性不影响碱基配对的特异性不影响探针分子的主要理化性质对酶促反应活性无影响或影响不大检测方法具有高度灵敏性和高度特异性,标记物种类：,核素标记物：32p、35s、3H非核素标记物半抗原：生物素、地高率配体：生物素是亲和素的配体荧光素：异硫氰酸荧光素、罗丹明等化学发光探针：标记物与某种底物反应发光，如生物素酰化的碱性磷酸酶可使发光底物发光,c.标记方法体内标记法：将核素标记的化合物作为合成代谢的底物，在细胞合成代谢时使核素掺入到新合成的核酸分子中，如3H-胸苷可掺入到DNA中，3H-尿苷可掺入到RNA中,体外标记法：化学标记法：标记物分子上的活性基因与探针分子上的某些基因反应，标记物直接结合到探针分子上酶促标记法：标记物预先标记核苷酸，然后利用酶促法将标记的核苷酸掺入到探针上,酶促标记法切口平移法（nicktranslation),利用DNaseI在DNA双链上造成单链切口利用大肠杆菌DNA聚合酶I的53核酸外切酶活性在切口处将旧链从5末端逐步切除在DNA聚合酶I的53聚合酶催化下，以互补的DNA单链为模板依次将dNTP连接到切口的3末端-OH上，合成新的DNA链，同时将标记的核苷酸掺入到新的DNA链中,随机引物法,其原理是随机引物能与各种单链DNA模板结合，作为合成新链的引物，在DNA聚合酶的催化下，按53方向合成一新的DNA链，其核苷酸序列与模板DNA完全互补。另一单链DNA模板同样合成一条新的完全互补的DNA链。合成时，带放射性核素标记的核苷酸掺入到新合成的DNA分子中,PCR标记法：将标记的核苷酸作为PCR反应的底物，以待标记的DNA为模板，经PCR反应，标记的核苷酸掺入到新合成的DNA分子中,d.探针的纯化乙醇沉淀法：无水乙醇可以沉淀DNA片段，可去除dNTP和蛋白质凝胶过滤柱层析法：利用凝胶的分子筛作用，将大分子DNA和小分子dNTP、磷酸根离子及寡核苷酸（80bp)等物质分离，常用凝胶基质是SephadexG-50微柱离心法：其原理与上述凝胶过滤柱层析法相同，不同的是上述采用洗脱的方式纯化探针，而此法则是利用离心的方式来纯化探针,(5)分子杂交技术的应用,分子杂交技术不仅广泛应用于科学研究方面，而且还主要用于遗传性疾病的诊断，如血红蛋白病的诊断、先天性遗传病的产前诊断等方面；内源性病变基因研究如癌基因检测、基因突变、基因缺失或变异引起的疾病的基因诊断；分子杂交技术也是诊断外源性病原体，如病毒、细菌、原虫等导致的疾病最常用的检测手段。在法医检测中分子杂交技术应用于有关性别鉴别和DNA指纹谱的鉴定。可将核酸分子探针检测比喻为在柴草堆中去找一根针的神奇技术。,2、DNA测序鉴定,通过对DNA测序，利用序列分析来确定该DNA分子是否为目标分子。,核酸测序Sanger的酶学测序原理Gilbert的化学测序法自动测序仪的发明,3、其他方法鉴定,PCR扩增RT-PCR扩增荧光定量PCR扩增,（三）核酸的扩增,1、DNA的体内扩增质粒在宿主细胞内的复制2、DNA的体外扩增PCR扩增（相应的PCR扩增技术）,基因体外扩增PCR技术1、基因扩增原理条件,典型的PCR反应条件,典型的PCR循环程序,*在PCR中，为了使先前扩增而尚未完成的产物能完成扩增常进行此循环,PCR中所用的一些DNA聚合酶,TaqDNA聚合酶的特性,引物设计的原则可采用primier5orOligo6软件设计,引物的长度通常在1530个核苷酸之间。引物越长，特异性越高，合成的成本也越高。常见的引物长度在20个碱基左右。G/C含量引物的G/C含量一般在50左右，G/C含量高，引物容易与模板结合，但如果过高，引物和模板结合过于紧密，会影响变性。G/C含量低，引物与模板不易结合。,引物二聚体在引物中不应出现发夹结构在引物中不应出现结合位点引物在目的DNA应该只存在一个结合位点，如果有多个结合位点，扩增时会出现非特异性扩增产物。引物的3端最好以G/C结束有利于延伸的正确进行。,问题：设计PCR上下游引物时应该注意的问题（2010南京大学考研题）,2、PCR的主要用途,目的基因的克隆基因的体外突变DNA和RNA的微量分析DNA序列测定基因突变分析,3、几种重要的PCR衍生技术,反转录PCR技术原位PCR技术实时PCR技术,原位PCR(In-situPCR),实时PCR技术原理,原位PCR是指直接用细胞涂片或石蜡片包埋组织切片在单个细胞中进行PCR扩增，然后用特异探针进行原位杂交检测含该特异序列的细胞的一种方法。,（四）、文库的构建,采用物理方法或限制性核酸内切酶将染色体DNA切割，继而将所获得的片段与适当克隆载体连接，将重组DNA转入受体菌中扩增，每个细菌内都携带一种重组DNA分子的多个拷贝。全部细菌所携带的各种染色体DNA片段就涵盖了基因组全部信息，这个携带所有基因组DNA的集合即称为基因组文库。以细胞mRNA为模板，利用反转录酶合成与mRNA互补的DNA，再复制成双链cDNA片段，与适当载体连接后转入受体菌，扩增后可获得含有相应cDNA的大量克隆，这些克隆就构成了cDNA文库。,1、基因组文库和cDNA文库,2、人工染色体构建1983年，美国的Dana-Farber癌症研究所和哈佛大学医学院的教授首次在Nature上发表文章，报道了构建YAC（YeastArtificialChromosome）库的过程。1987年，Burke等人发现，仅仅带有ARS序列的载体虽然能够被复制，但极易在有丝分裂时丢失。即使在选择培养基上，也只有5%-20%的子代细胞带有ARS载体。加入Centromeres（CEN）能显著提高ARS质粒在有丝分裂时的稳定性，90%以上子代细胞带有该载体。CEN还能显著降低拷贝数，从20-50/细胞降为1-2/细胞。（Science,236:806-812）。,人工染色体含有三种必需成分：着丝粒、端粒和复制起点。着丝粒(CEN)位于染色体中央，呈纽扣状结构，在有丝分裂时结合微管并调控染色体的运动，也是姐妹染色单体配对时的最后位点，接收细胞信号而使姐妹染色体分开。端粒（TEL）：主要功能是防止染色体融合、降解、确保其完整复制。端粒酶以其自身RNA为模板，在染色体端部添加上端粒重复序列，并参与端粒长度和细胞增殖的调控。复制起点：DNA复制通常由起始蛋白与特定的DNA序列相互作用开始。DNA合成的起始位点和DNA复制起点(遗传位点)所需的Cis靶区常位于同一段长约100bp的DNA上。,YAC的主要缺点1存在高比例的嵌合体，即一个YAC克隆含有两个本来不相连的独立片段；2部分克隆子不稳定，在转代培养中可能会发生缺失或重排；3难与酵母染色体区分开，因为YAC与酵母染色体具有相似的结构。4操作时容易发生染色体机械切割。,以细菌寄主系统为基础的克隆载体形成嵌合体的频率较低，转化效率高，又易于分离。科学家用染色体建造法用F质粒及其调控基因构建细菌载体，克隆大片段DNA。该质粒主要包括oriS，repE（控制F质粒复制）和parA、parB（控制拷贝数）等成分。,BAC的优点1易于用电击法转化E.coli（转化效率比转化酵母高10-100倍）；2超螺旋环状载体，易于操作；3F质粒本身所带的基因控制了质粒的复制；4很少发生体内重排。有人把人类染色体端粒DNA上单个-卫星DNA单元多聚化形成1Mb左右的大片段并与人类基因组DNA混合，产生了能被复制、能正常分裂并得到长期稳定保存的人工合成的染色体，长度约为6-10Mb，称为MAC或HAC。,细胞破碎离心电泳（SDS-PAGE、双向电泳、脉冲电泳等）分离及纯化,蛋白质的分离纯化蛋白质鉴定蛋白质保存,蛋白质鉴定：分子大小电泳比对、质谱分析结构鉴定X射线、MNR抗原性鉴定、活性鉴定,蛋白质保存：真空干燥干粉冷冻抽干冻干粉,二、蛋白质操作技术,第二节生物大分子互作研究技术,在分子生物学研究中，除了利用核酸分子间的杂交技术外，还利用核酸与蛋白质之间，甚至蛋白质与蛋白质之间的杂交技术来研究生物大分子之间的相互作用。现简介如下：,一、DNA-蛋白质相互作用研究技术,（一）凝胶阻滞实验（Gelretardationassay）又叫DNA迁移率变动实验（DNAmobilityshiftassay），是上世纪80年代初期出现的用于在体外研究DNA与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。它具有简单、快捷等优点，也是当前被选作分离纯化特定DNA结合蛋白质的一种典型的实验方法。,凝胶阻滞实验的基本原理,（二）染色质免疫沉淀法,染色质免疫沉淀法（chromatinimmuno-precitation，ChIP）是研究体内DNA与蛋白质相互作用的重要工具。它可以灵敏地检测目标蛋白与特异DNA片段的结合情况，还可以用来研究组蛋白与基因表达的关系。,染色质免疫沉淀法的基本原理,（三）DNase足迹实验（footprintingassay）是一类用于检测与特定蛋白质结合的DNA序列的部位及特性的专门的实验技术。足迹实验的一个明显优点是，可以形象地展示出一种特殊的蛋白质因子同特定DNA片段之间的结合区域。如果使用较大的DNA片段，通过足迹实验便可确定其中不同的核苷酸序列与不同蛋白质因子之间的结合单位的分布状况。如同凝胶阻滞实验一样，我们也可以加入非标记的竞争DNA序列，来消除特定的“足迹”，并据此测定其核苷酸序列的特异性。,（四）甲基化干扰实验（methyltioninterferenceassay）,根据DMS（硫酸二甲酯）能够使G残基甲基化，而六氢吡啶又能够特异切割甲基化的G残基这一原理，设计出了另一种研究DNA与蛋白质相互作用的实验方法，即甲基化干扰实验。这种技术可以检测靶DNA中特异G残基的优先甲基化对而后的蛋白质结合作用究竟会有什么效应，从而更加详细地揭示DNA与蛋白质之间相互作用的模式。DMS化学干扰的主要局限性时，它只能使G残基甲基化。尽管如此，它仍不愧为足迹实验的一种有效的补充手段，可以鉴定足迹区段中DNA与蛋白质相互作用的精确位置。具体操作如下页图所示。,甲基化干扰实验,二、RNA干扰技术（RNAinterference，RNAi）,RNA干扰是与靶基因序列同源的双链RNA所诱导的一种特异性的转录后基因沉默现象.它是一种跨越多种种属的古老的生物途径,同时它的出现为生物学家提供了一种快速、简便的反向遗传学技术,在后基因组时代功能基因的研究中具有重要的应用前景.,（一）RNAi的发现,1990年,为加深矮牵牛花(petunias)的紫色,Jorgensen等导入了一个强启动子控制的色素基因。结果许多花瓣颜色并未加深,反而呈杂色甚至白色。这是由于转基因和同源的内源基因的表达都被抑制了，Jorgensen把这个现象命名为共抑制(cosuppression)。,1998年,AndrewFire等在秀丽隐杆线虫(C.elegans)中的研究证明,在正义RNA阻断基因表达的试验中,真正起作用的是双链RNA(double-strandedRNA,dsRNA)。他们将dsRNA注入线虫体内后可抑制序列同源基因的表达,并证实这种抑制主要作用于转录之后,所以又称RNAi为转录后基因沉默(posttranscriptionalgenesilencing，PTGS)1999年,Hamilton等在植物基因沉默的研究中首次发现,2125nt的dsRNA的出现对转基因导致基因沉默十分重要,而在转基因正确表达的植株中则未出现。,Hammond等进行的细胞提取物核酸酶活性实验，证明了这些小分子双链RNA（siRNA）在RNAi中的作用。随后人们陆续在果蝇(Drosophila)、锥虫(Trypanosomes)、涡虫(Planaria)、斑马鱼(Zebrafish)、拟南芥(Arabidopsisthaliana)、大小鼠和人体内发现了RNAi现象。,（二）RNAi的作用原理,双链RNA（dsRNA）(外源的或体内产生的)首先被降解为具5单磷酸、长2123bp的小分子双链RNA,这种RNA小分子称为小干扰RNA（SmallInterferingRNA，siRNA）。siRNA具相似的结构特征:为长约2123bp的双链RNA,具5单磷酸和3羟基末端,互补双链的3端均有一个23nt的单链突出。,1.siRNA的产生,一种称为Dicer的核酸酶负责将dsRNA转化为siRNA。它属于RNase家族,具有两个催化结构域、一个解旋酶(helicase)结构域和一个PAZ(Piwi/Argonaute/Zwille)结构域,Dicer在催化过程中以二聚体的形式出现,其催化结构域在dsRNA上反平行排列,形成四个活性位点,但只有两侧的两个位点有内切核酸酶活性,这两个位点在相距约22bp的距离切断dsRNA,各种生物体内Dicer结构略有不同,致使siRNA长度存在微小差别。,2.siRNA介导mRNA降解,siRNA形成之后,与一系列特异性蛋白结合形成siRNA诱导干扰复合体(siRNAinducedinterferencecomplex,RISC),在ATP存在下，此复合物通过碱基互补配对识别靶mRNA并使其降解,从而导致特定基因沉默。,3.RNAi的特异性和高效性,许多研究显示RNAi过程中有新的dsRNA分子的合成。当siRNA反义链识别并结合靶mRNA后,siRNA反义链可作为引物,以靶mRNA为模板在依赖于RNA的RNA聚合酶(RNAdependentRNApolymerase,RdRP)催化下合成新的dsRNA,然后由Dicer切割产生新的siRNA,新siRNA再去识别新一组mRNA,又产生新的siRNA,经过若干次合成2切割循环,沉默信号就会不断放大。,（三）RNAi的生物学功能,通过组蛋白甲基化影响染色质结构:Volpe等（2002）的研究表明，至少在裂殖酵母中,RNAi机制可通过组蛋白甲基化改变染色质结构造成着丝粒区域基因沉默。通过DNA甲基化在转录水平调节基因表达对RNAi相关基因。在翻译水平调节机体发育。作为基因组的免疫系统。研究表明RNAi机制在真核细胞中起着类似动物免疫系统的作用,充当基因组的防护者。,（四）RNAi技术的应用,基因功能研究：利用RNAi技术使目的基因沉默，研究基因的功能。如利用RNAi技术证明ag-1基因与拟南芥花的发育有关。,Chiou-FenChuangandElliotM.Meyerowitz*PNASApril25,2000vol.97No.949854990,（四）RNAi技术的应用,2.临床应用：RNAi机制可作为真核生物的基因组免疫系统,抑制外源和内源有害基因的表达。利用RNAi技术把与病毒基因具同源性的siRNA引入感染细胞将会抑制病毒的增殖,这为病毒相关疾病的治疗提供了新的思路。利用RNAi技术抑制过度表达的癌基因将会使癌症表型逆转或病程得以控制。,TheHumanImmunodeficiencyVirus(HIV)LifeCycleandRNAInterference.NEnglJMed,Vol.347,No.17October24,2002,（一）酵母双杂交系统,酵母双杂交系统是检测蛋白与蛋白相互作用的遗传分析实验，即检测蛋白质相互作用的实验。,三、蛋白质相互作用研究技术,1酵母双杂交系统的基本原理,酵母双杂交系统的建立是基于对酵母转录激活因子GAL4分子的研究。如果将GAL4分子的DNA结合区（bindingdomain，BD）和促进转录的活化结构域（activationdomain，AD）分开，两者不能表现出对下游基因表达的激活作用。如果BD和AD分别融合了具有配对相互作用的两种蛋白质分子后，就可以依靠所融合的蛋白质分子之间的相互作用而恢复对下游基因的表达激活作用。,2、模型,3、报告基因,LacZreporter-Blue/WhiteScreeningHIS3reporter-ScreenonHis+media(usuallyneedtoadd3ATtoincreaseselectivity)LEU2reporter-ScreenonLeu+mediaADE2reporter-ScreenonAde+mediaURA3reporter-ScreenonUra+media(candonegativeselectionbyaddingFOA),4、假阳性的问题,假阳性是酵母双杂交系统的最大问题假阳性通常由以下原因造成:prey蛋白的非特异性结合无需与诱饵蛋白结合就能诱导报告基因的转录（这是大多数假阳性的诱因）,5、酵母双杂交的优点,快速获得相互作用蛋白的基因只需单一步骤的质粒构建在体内鉴定蛋白的相互作用弱小的，暂时的相互作用也能鉴定能在整个时间段积聚弱小的相互作用信号,6、酵母双杂交系统应用,（1）分析已知蛋白质之间的相互作用（2）对蛋白质功能域的分析（3）分析未知蛋白质相互作用（4）绘制蛋白质相互作用系统图谱（5）在药物设计中的应用,酵母双杂交应用举例,蛋白级联底物的鉴定钙调蛋白与L-异天冬氨酰甲基转移酶的相互作用E2F1突变子的遗传特性多肽荷尔蒙受体相互作用Pha-4在线虫C.elegans中的相互作用,（二）噬菌体展示技术,噬菌体展示（phagedisplay）技术是将外源蛋白或多肽与噬菌体外壳蛋白融合并呈现于噬菌体表面的技术。通过与特定的靶标反应（如抗体、受体、配基、核酸