第二章 DNA操作基本问题.ppt

第二章DNA操作基本问题,DNA提取DNA分离纯化DNA沉淀DNA检测分子生物学实验仪器设备,DNA提取,质粒DNA的提取细菌细胞破碎-碱使染色体DNA变性-离心分离-收集质粒DNA-纯化-保存真核细胞DNA的提取研磨使细胞破碎-蛋白酶K去核蛋白-分离蛋白质与DNA-纯化-沉淀-纯度检测,质粒DNA的提取,细菌细胞破碎-碱使染色体DNA变性-离心分离-收集质粒DNA-纯化-保存,DNA纯化,RNA酶去RNASDS-蛋白复合物蛋白酶K去蛋白质酚-氯仿抽提纯化试剂盒紫外分光光度计测A260与A280值：18或20,SDS的作用,十二烷基硫酸钠，离子型表面活性剂溶解细胞膜上的脂质与蛋白解聚核蛋白与蛋白质结合成复合物有毒，是一种刺激物，避免吸入粉末,酚与氯仿的使用,酚与氯仿是非极性分子，水是极性分子，当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时，蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去，使蛋白失去水合状态而变性，离心后沉淀在下层，而DNA水溶液在上层。虽然酚比氯仿变性效果好些，但酚与水相有一定程度的混溶，而氯仿与水不混溶，所以混合使用酚与氯仿比较好。酚要用Tris-HCl缓冲液饱和，并调PH到8，使DNA更稳定，获得RNA含量较少的DNA样品。,DNA沉淀,二倍体积的无水乙醇与DNA相混合。使乙醇的终含量占67%左右。室温静置30分钟。乙醇沉淀时，加NaAcorNaCl至终浓度为01-025M，是为了中和DNA分子在碱性条件下所带的负电荷，减少DNA分子同性电荷的相斥力。06倍体积的异丙醇沉淀，-20C半小时。聚乙二醇（PEG）可以选择性沉淀DNA。DNA大分子所需的PEG浓度低，小分子所需的PEG浓度高。,DNA分离,琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳氯化铯密度梯度离心,氯化铯密度梯度离心,氯化铯是一种高分子量的重金属盐，在超速离心场较长时间力的作用下，会在离心管中形成浓度梯度。染色体DNA，质粒DNA及RNA在此密度梯度中的密度不同，从而达到分离它们的目的。EB可以与线性染色体DNA分子结合，从而减小它的浮力密度。,DNA浓度检测,琼脂糖凝胶电泳0.05-0.1gEB-标准DNA浓度比较:1ng紫外分光光度计测A260:0.1-1ideal,0.05-1.5accepted纯度:分光光度计不但能确定核酸的浓度，还可以通过A260/A280估计核酸纯度。纯DNA其比值为1.8，纯RNA为2.0。如比值高于1.8，说明DNA样品中含RNA，而样品中的酚和蛋白质将会导致比值降低。,EB与DNA,DNA大小测量,凝胶上与标准分子量比较HindIII100bpladder自己的marker,琼脂糖凝胶电泳检测DNA大小,在紫外透射仪下观看DNA时，DNA亮度与,DNA浓度DNA大小波长纯度EB量等有关,DNA电泳结果,分子生物学实验中DNA操作的注意事项：,细心严格无菌规范安全,分子生物学基本仪器设备,超净工作台培养箱和水浴锅冷冻设备灭菌设备离心机真空干燥电泳设备分光光度计与紫外透射仪摄影设备搅拌器,显微照相及图像采集系统,荧光差异显示系统,高速冷冻离心机,冷冻切片机,转基因仪,流式细胞仪,2D凝胶成相分析系统,DNA测序仪,无感染动物房,飞行时间质谱仪,电喷雾质谱仪,蛋白质序列分析仪,高效液相色谱系统,分子生物学器皿,微量移液器Tip头EP管，离心管培养皿三角瓶,灭菌