《DNA甲基化酶》PPT课件.ppt

第二节甲基化酶Methylase,Methylation,methyltransferase,原核生物甲基化酶是作为限制与修饰系统中的一员，用于保护宿主DNA不被相应的限制酶所切割。,二、甲基化酶的种类,在真核和原核生物中存在大量的甲基化酶，,在E.coli中大多数都有三个位点特异性的DNA甲基化酶,Dam甲基化酶DNAAdeninemethylase,GATC腺嘌呤N6位置引入甲基,PvuIIBamHIBclIBglIIXhoIIMboISau3AI识别位点中含GATC序列ClaI(1/4)XbaI(1/16)TaqI(1/16)MboII(1/16)HphI(1/16)部分识别序列含GATC序列4个ClaI位点(ATCGATN)中有一个该序列,有些限制酶对Dam甲基化敏感不能切割相应的序列如:BclI,ClaI,MboI,XbaI等这;甲基化敏感的限制性内切酶.不敏感的有BamHI,Sau3AI,BglII,PvuI等.Mbo和Sau3A识别和切割位点相同，但其差异就在于前者对甲基化敏感。,一般哺乳动物DNA不会在A-N6上甲基化当需要在敏感位点上完全切割DNA时，必须从dam-E.coli中提取DNA,Dcm甲基化酶DNAcytsinemethylase,识别CCAGG或CCTGG序列在第二个C上C5位置上引入甲基,EcoRII/BstNICCA(T)GG二者识别序列相同，但切点不同EcoRII受dcm甲基化作用影响BstNI可避免这一影响,受影响酶有：Acc65IGGTACCAlwNIApaIGGGCCCEcoRIIEaeI等,不受影响酶有：KpnIGGTACCBanIIBg1IBstNINarIGGCGCC等,3.EcoKI甲基化酶,识别AAC(N)6GTGCTTG(N)6CACGAN6位置但识别位点少(1/8kb)研究较少而dam（1/256bp）dcm(1/512bp),4.SssI甲基化酶,来自原核生物Spiroplasma,CG序列中的C在C5位置上甲基化,可在未甲基化或半甲基化链上起作用,许多酶对此甲基化敏感AatIIClaIXhoISalI等不敏感的有BamHIEcoRISphIKpnI,SssI甲基化的DNA受E.coliMcrA,McrBC,Mrr系统的限制,5.其它甲基化酶,DNMT11988年克隆出的真核生物的甲基转移酶.具有催化作用的c端和调节功能的N端.,三、依赖于甲基化的限制系统,E.coli中至少有3种依赖于甲基化的限制系统它们识别的序列各不相同，但只识别经过甲基化的序列,依赖于甲基化的内切酶,mcrA,mcrBC,mrr,都限制由CG甲基化酶(MSssI)作用的DNA,Mrr也限制m6A,McrBC切割两套位点（G/A）mC，这两套位点之间间隔2kb，最适为55103bp，需GTP,大多数常用的E.coli受体都含这三个限制系统,三个都不限制Dam,EcoKI,EcoRI修饰的位点,McrA限制HpaII(CCGG)甲基化修饰的位点,四、甲基化对限制性内切酶酶切的影响,1.修饰酶切位点,HincIIGTCGACGTCAACGTTGACGTTAAC,M.TaqI甲基化TCGA中的A，所以M.TaqI处理DNA后，GTCGAC将不受HincII切割,BamHIGGATCCM.MspIm5CCGG如果BamHI前面为CC或后面为GG，那么M.MspI处理的DNA抵抗BamHI的切割,构建DNA文库时用AluI(AGCT)和HaeIII(GGCC)部分消化基因组DNA用M.EcoRI甲基化酶处理，然后加上合成的EcoRI接头当再用EcoRI来切割时只有接头上的位点可被切割,2.产生新酶切位点TCGATCGAAGCTAGCTTaqITaqIM.TaqITCGA*TCGA*AGCT*AGCTDpnI,3.用于研究细胞DNA中位点特异性甲基化的水平及分布哺乳动物m5CG、植物的m5CG，m5CNG肠道细胞的Gm6ATCCm5/4CGGMspI可切割，HpaII不可切割Gm6ATCSau3AI可切割，MobI不可切割其它,4.对基因组作图的影响,在哺乳动物DNACpG序列出现的频率大约只有预计的1/5含CpG序列的识别序列极其稀少,大多数