中药质量控制方法研究进展PPT课件

中药质量控制方法研究进展,1,.,中药质量控制重要性,中药学是中国传统文化的瑰宝，有着悠久的历史和广阔的发展前景。中药的有效成分种类繁多，每味药的有效成份也会由于药材的产地、加工、采集时节而有所不同。传统中药加工而成的中成药，多为复方制剂，由每味药的有效成份单独和协同发挥药效，作用机理情况较为复杂。因此，为确保中成药的质量，必须对其进行质量控制。,2,.,中药指纹图谱技术,化学计量学方法,一测多评,有效成分与药效结合,生物效价检测方法,3,.,中药指纹图谱技术,1.1色谱指纹图谱1.2光谱指纹图谱1.3核磁共振氢谱1.4X射线衍射法1.5分子生物学法,4,.,1.1色谱指纹图谱技术,薄层色谱（TLC）,气相色谱（GC）,高效液相色谱,高效毛细管电泳色谱,色谱指纹图谱,色谱指纹图谱,李强等，中药指纹图谱技术进展及未来发展方向展望，中草药J，2013,44（22）：3095-3105,5,.,1).薄层色谱指纹图谱（TLC）,通过提供大量信息，采用固定波长对每个薄层进行扫描，其扫描图谱较目测层析图谱更准确，对指纹鉴别意义较大，常用于道地药材的鉴别。,TLC法属于半定量、定性的色谱分析法特点：分析速度快、操作简单、分析样品数多,米莉莉等对不同虫草样品建立荧光淬灭薄层色谱指纹图谱，得到的荧光淬灭薄层色谱指纹图谱，能为人工虫草和天然虫草提供直接的指纹鉴别，方法快速简便、重现性好。,6,.,2).气相色谱指纹图谱技术,7,.,3).高效液相色谱指纹图谱（HPLC）,用途：主要用于分离较难，且成分复杂的中药材特点：分离过程不需气化，其检测手段较多，灵敏度高、分析速度快、分离效能高是目前应用最广泛的色谱分析法。,HPLC技术始于20世纪60年代未，是以经典液相色谱法为基础，并引进了气相色谱法的理论及实验方法，流动相以高压输送，采用高效固定相及在线检测手段。,张秋红等采用HPLC法建立黄芪中黄酮类成分指纹图谱，标示其共有峰与特征峰，进行相似度评价及聚类分析。结果该方法精确性高，精密度好，对黄芪的质量控制提供了一定方法学的依据。,8,.,4).高效毛细管电泳指纹图谱（HPCE）,广泛应用于中药化学成分的分离、鉴别和含量测定。特点：分析速度快，进样量少，分离效率高，试剂消耗少，抗污染能力强以及水溶性样品的“指纹”特征性强可弥补高效液相色谱分析中药成分时存在的缺陷，适合中药复杂体系的分离分析李峰等建立土鳖虫药材的高效毛细管电泳指纹图谱鉴别方法，通过中药色谱指纹图谱相似度评价系统，确定6个共有峰构成土鳖虫药材指纹图谱的特征峰，为药材品种鉴定与质量控制提供了依据。,9,.,1.2光谱指纹图谱技术,紫外光谱指纹图谱,荧光光谱指纹图谱,红外光谱指纹图谱,IR,一种分子吸收光谱，能够鉴别整个化合物，专一性更强,UV,紫外光谱法是中药及其制剂质量分析中常用的一种方法，对具有紫外吸收的已知化合物进行定性、定量,荧光光谱,荧光光谱能形象地反映出荧光组分的各种信息,郑颖，中药指纹图谱研究进展，天然产物研究与开发，2003,14（1）：55-61,10,.,1).红外光谱指纹图谱技术,11,.,2).紫外光谱指纹图谱技术,12,.,3).荧光光谱指纹图谱技术,13,.,1.3核磁共振氢谱指纹图谱技术,特点,优点：有多种结构信息，应用范围广，结果精确缺点：成本高，有辐射,应用,张瑜等建立关黄柏的1H-NMR指纹图谱方法，对关黄柏的总提取物、总生物碱提取物和总柠檬苦素提取物三者的指纹图谱进行对比分析研究。图谱主要显示黄柏酮、黄柏内酯的特征共振信号；各图谱能够很好地表征出主要成分的特征信号，可以作为关黄柏指纹图谱研究的辅助方法以控制中药质量。,核磁共振氢谱对有机化合物所提供的结构信息具有高度的特征性，通过化学成分分离纯化后各化合物的结构鉴定和核磁共振氢谱谱图进行研究,14,.,1.4X射线衍射法,特点,样品前处理只需进行物理（粉碎）加工，不需化学处理，可保持样品组分全貌，所需样品量小，操作快捷方便，所获得的图谱信息量大、指纹性强、稳定可靠，作为样品定性鉴别的依据可靠性强。目前建立的方法中以动物、矿石类药材居多，但也不乏植物药材。,应用,王丽娟等用粉末X射线衍射技术建立了麋鹿角X射线衍射Fourier指纹图谱分析方法，并与鹿角进行指纹图谱比较分析，为麋鹿角的开发利用、药材品质评价提供了依据与方法。,X射线衍射法的原理是当某一物质受到X射线照射会产生不同程度的衍射现象。该物质产生特有的衍射图谱反映了物质的组成、晶型、分子内成键方式及分子的构型等特征。,王丽娟等，麋鹿角的X射线衍射Fourier指纹图谱研究J，中药材，2009,32(5):667-669,15,.,1.5分子生物学法,特点,应用于中药来源与品质的鉴定优点：方便快速、准确可靠缺点：方法费时费力,应用,吴婷等以14批不同产地连翘药材，分析不同产地连翘的遗传多样性，建立其特征性的DNA指纹图谱，为连翘的道地性、遗传育种提供理论依据和方法措施。,其理论基础是基因的多态性，而基因多态性可在分子水平上进行检测。采用DNA分子进行标记，通过检测DNA上生物分子间的差异来鉴定药材，由于DNA分子标记技术直接分析的是生物遗传因子而非表现型,所以结果可不受环境因素、样品状态和材料来源等外界条件的影响。,吴婷等，不同产地连翘的DNA指纹图谱构建与聚类分析，中草药J,2016，47(5)：816-820,16,.,化学计量学方法,2.1主成分分析法2.2聚类分析法2.3判别分析法,贰,17,.,2.1主成分分析法（PCA）,张兴辉等应用主成分分析法（PCA）对来源于全国不同产地的女贞子进行了化学模式识别研究,结果显示不同产地的女贞子化学成分的差异较大，炮制后也对成分有较大影响,表明PCA分析法化学模式识别研究可用于女贞子的质量价定。,PCA是对多变量数据进行统计处理的一种线性投影判别方法，是在不明显减少有用信息的前提下，将高维空间压缩到低维空间，通过对原特征（经标准化后的）变量进行线性组合，形成若干个新的特征矢量，要求它们之间相互正交，并能最大限度地保留原样本集所含的原始信息，这些矢量即称为主成分。,张兴辉.中药女贞子化学成分的研究.第二军医大学学报.2004,18,.,2.2聚类分析方法,聚类就是根据数据将样本分成多个类。同类样本之间具有较高的相似度，异类间的样本差别较大。聚类分析的目标是在模式空间中找到客观存在的类别，“物以类聚”是聚类分析的基本出发点。,聚类分析,如何区分这16张牌？,原理,19,.,1).聚类分析方法原理,20,.,21,.,2).应用,特征元素标准化处理后以欧氏距离平方为测量准则、以组间连结法为组群合并准则，用SPSS17.0统计软件进行系统聚类分析，聚类分析树状图见图1.由树状图可知，当将补阳类中药为中药分为3类时，西洋参为一类，白术为一类，山药、大枣、生晒参、白扁豆、甘草、党参及黄芪7味中药归为一类。,黄赛金.补气类中药矿质元素主成分分析和聚类分析研究.湖南工程学院学报.2016,22,.,2.3判别分析法,方法,引言,分类,联系,两个总体判别分析和多总体判别分析,判别分析法与聚类分析的区别与联系,判别分析法概念,距离判别法Fisher判别法Bayes判别法,23,.,判别分析是用于判别个体所属群体的一种统计方法，判别分析的特点是根据已掌握的、历史上每个类别的若干样本的数据信息，总结出客观事物分类的规律性，建立判别公式和判别准则。然后，当遇到新的样本点时，只要根据总结出来的判别公式和判别准则，就能判别该样本点所属的类别。判别分析是一种应用性很强的统计数据分析方法。,1).判别分析概念,24,.,两个总体判别分析和多总体判别分析常用的几种判别分析方法：距离判别法、Fisher判别法、Bayes判别法和逐步判别法。,2).分类,25,.,a).距离判别法,两个总体的距离判别问题：设两个总体G1和G2，对于一个新的样品X，要判断它来自哪个总体。方法：按就近原则归类。求新样品X到G1的距离与到G2的距离之差，如果其值为正，X属于G2；否则X属于G1。根据上述准则可以推导出一个判别函数W，把待判样品的值代入判别函数，根据计算结果是否大于0得出判别结论。,26,.,距离分析法中的距离定义,样品X到总体G的距离，理解为样本到总体中心的距离欧氏距离马氏距离马氏距离不受变量间的相关性和量纲的影响,b).距离判别法,27,.,c).Fisher判别法,借助方差分析的思想构造一个线性判别函数：确定判别函数系数时要求使得总体之间区别最大，而使每个总体内部的离差最小。从几何的角度看，判别函数就是p维向量X在某种方向上的投影。使得变换后的数据同类别的点“尽可能聚在一起”，不同类别的点“尽可能分离”，以此达到分类的目的。,28,.,d).Bayes判别法,设有K个总体，样品来自各个总体的先验概率为pi，各总体的密度函数为fi(x)，在观测到一个样品X的条件下，可以根据贝叶斯公式计算出它来自某个总体的后验概率。待判样品属于哪一类的后验概率最大，就把它分入哪一类。一般假设服从多元正态分布、各总体的协方差矩阵相等。,29,.,聚类与判别,聚类分成几类每个样品属于哪一类判别已知分成几类根据样品建立判别函数根据判别函数对样品进行分类,30,.,一测多评,3.1一测多评的提出3.2一测多评的原理3.3一测多评的应用3.4小结,31,.,1).中药本身的特点,1,2,3,4,三多：有效成分多、未知成分多、杂质多,含量差异大，作用十分复杂,一药多能,多种中药含有相同的成分,3.1一测多评的提出,32,.,2).目前中药质量评价的焦点难点,01,如何科学客观的评价中药质量？如何设立科学生产何合理的标准？,所设立的标准是否实用？,检查方法是否具有可操作性？检测成本和效率是否适宜科研、生产何监督？,03,02,33,.,3).传统的检测方法,借鉴化学药品的质量控制模式，依靠天然药物化学的发展。建立以测定某单一成分为目标的分析方法何即定性又定量的质量标准。但中药成分复杂，仅以一种成分含量无法全面反映中药质量的优劣，由此提出了多成分质量控制的理念。但传统的多成分质量控制存在一定的缺陷，例如：当对照品缺乏时则无法检测。,孙琴等.中药质量控制和评价模式应多元化J.中药材.,34,.,4).一测多评的基本设想,35,.,5).一测多评的发展,2006年王智民等人首次提出了一测多评的质量评价2007年获得中医药行业科技专项资助2008年邹桂欣等首次以中药复方制剂冠脉康胶囊为研究对象进行了一测多评法的探索研究。2010年孔晶晶等首次采用一测多评法测定多种不同类型成分的含量，重点探讨了不同类型化合物之间一测多评法的准确性和可行性。2010年作为新的质量评价方法，为中国药典所采纳，应用于黄连质量评价。,王智民等.一测多评法中药质量评价模式方法学研究J.中国中药杂志.邹桂欣等.一测多评法在冠脉康胶囊多种成分检测中的应用研究J.中国中药杂志.孔晶晶等.一测多评法测定连翘中多种不同类型成分的含量J.中国药学杂志.,36,.,2012年赵君颖等首次以中药材炮制品酒黄连、萸黄连、姜黄连为研究对象进行了一测多评法的探索研究2012年安士影等首次以中药材提取物紫锥菊提取物为研究对象，用一测多评法对市售国内紫锥菊提取物中多酚的含量进行了测定，为其综合质量评价提供研究依据。目前已应用于木通、大黄、黄芩、人参、三七、秦皮、金银花、连翘等药材的定量评价,赵君颖等.一测多评法比较不同黄连炮制品中4种生物碱的含量J.中国实验方剂学杂志.安士影等.市售国内紫锥菊提取物质量评价J.中国中药杂志.,37,.,3.2一测多评的原理,一测多评法（quantitativeanalysisofmulti-componentsbysingle-marker，QAMS）法是针对某些对照品缺乏或难得到，只测定其中一个对照品易得有效成分，根据成分内在的函数和比例关系实现同时测定多个成分含量的分析方法。,周洁等.一测多评法及其在中药成分研究中的应用J.亚太传统医药.,1).概念,38,.,2).适用范围,适用于对照品难得或制备成本高或不稳定的情况下同类多成分同时测定,王智民等.一测多评法建立的技术指南J.中国中药杂志,39,.,3).原理,在一定的线性范围，成分的量（质量或浓度）与检测器响应成正比。在多指标（s，a，b，i)质量评价时，以药材（或成药）中某一典型有效成分作内参物（s），建立内参物与其它待测成分（a,b,I)间的相对校正因子（RCF，fsa，fsb，fsc，.），按公式(1)计算：,公式（1）,王智民等.一测多评法建立的技术指南J.中国中药杂志.,40,.,在方法学建立时，主要是求出内参物与各待测成分间的RCF，并把它作为一个常数用于含量测定中【药典附录VID3(3)】。在测定含量时，内参物（s）的浓度可按常规方法（药典附录VID）进行测定（Cs）；应用RCF（），结合内参物（s）实测值Cs，计算待测成分（a，b，。，I，。）的浓度Ci，间公式（2）：,公式（2）,41,.,核心思想：在相同条件下,42,.,4).一测多评评价模式的总体思路,有效成分主要成分,成分间RCF建立重现性专属性准确性定量限线性范围耐用性,制定标准制定SOP,指标选择,QAMS建立,标准建立,43,.,5).一测多评特点,能够对中药材或中成药中的多个指标成分进行含量测定，符合中药质量控制的多成分、多指标的发展要求更加经济、节约、快捷，该方法建立之后不需要待测的所有组分都有或者使用对照品，更不需要对每个组分都建立含测方法及相关的考察，实现了以一种对照品的检测实现多指标同步测定和质量评价，相对而言节约了成本，提高了效率该法的建立，比传统方法，更加复杂、要求更加严格,44,.,3.3一测多评的应用,药材黄连、木通、大黄、黄芩、人参、三七、陈皮、金银花、连翘等,成分芳香类（黄铜类、香豆素、木脂素、蒽醌等）、生物碱（异喹啉类、吲哚类等）、萜类（单贴、二萜、三萜等）等。,谢伟杰等.一测多评法在中药学领域的研究应用进展J.贵阳中医学院学报,45,.,一测多评法测定玄参中7种有效成分的含量,玄参为研究对象，采用高效液相色谱法，以玄参中梓醇、桃叶珊瑚苷、哈巴苷、毛蕊花糖苷、安格洛苷C、哈巴俄苷、肉桂酸共7种有效成分为质量指标，以梓醇为内标物，建立的梓醇与其它6种成分的相对校正因子，并在此基础上建立“一测多评”测定方法。同时采用外标法测定这7种成分的含量，比较两者的测定结果。结果表明采用“一测多评”法和外标法测定的含量之间无显著差异，实验所得的校正因子可信。,喻欢欢等，一测多评法测定玄参中7种有效成分的含量J.中国中药杂志.,实例：,46,.,喻欢欢等，一测多评法测定玄参中7种有效成分的含量J.中国中药杂志.,47,.,3.4小结,一测多评法是中药多指标质量控制的一种新颖的模式。在缺乏对照品的情况下，一测多评法通过一种方便、经济、高效的含量测定方法，解决了中药对照品匮乏的瓶颈问题，实现了中药及其制剂的多组分定量，降低了实际生产中的检测成本，提高了中药及其制剂的质量标准。是中药多组分同步监测的发展方向，是中国药典2015年版品种修订中重点推广的技术。,王智民等.一测多评法建立的技术指南J.中国中药杂志.,48,.,有效成分与药效结合,肆,4.1生物色谱法4.2脂质体平衡透析/液相色谱质谱联用方法4.3细胞固相萃取/液相色谱质谱联用法4.4微透析生物取样/液相色谱质谱联用法,49,.,细胞膜生物色谱法,有效成分与药效结合,现代药物分析技术,生物活性测定,生物活性筛选/化学在线分析技术,50,.,生物活性筛选/化学在线分析技术是由生命科学与色谱分离技术交叉形成的一种综合技术，它利用药物产生作用(或毒性)一般通过药物与靶点结合的原理，将酶、受体、离子通道、神经介质、抗体、传输蛋白、DNA、肝微粒体等在生命活动中起重要生理作用的活性生物大分子、活性细胞膜甚至活性细胞固着在色谱载体上作为靶标，因其具有生物活性，故能特异性地与人类生命活动有关的各种生物活性物质结合。,生物活性筛选/化学在线分析技术,51,.,生物活性筛选/化学在线分析技术,生物活性材料能够特异性、选择性地与活性成分结合，排除大量无结合成分的干扰，降低分析量，对中药中可能有作用成分进行快速初步筛选，并且能够用色谱的各种技术参数定量表征中药中各成分与各靶标间的作用强度，所得分析图谱可以为中药质量控制提供依据。,52,.,4.1生物色谱法,生物活性填料,药物,技术参数,现代色谱技术,53,.,4.1生物色谱法,生物色谱法,分子生物色谱,生物膜色谱,模拟生物膜,细胞膜色谱,对于中药等成分复杂的研究对象,生物色谱法由于固定相能够特异性、选择性的与活性成分结合,排除大量非作用杂质成分的干扰,而且可以将中药的提取液直接进样,毋需预处理、纯化等多个分离步骤,分析速度快,是研究中药等复杂对象的有效手段。,54,.,4.2脂质体平衡透析/液相色谱质谱联用方法,该法以中药提取物为对象，采用HPLC法分离和分析，比较中药、复方提取物直接透析和中药提取物与模拟生物膜（脂质体）混合透析后所含各种物质峰面积的变化，其中峰面积显著减少的峰，则是与模拟生物膜（脂质体）有作用的成分，应用在线LC/MS等技术鉴定这些成分，就可从复杂的中药体系中筛选出能与模拟生物膜（脂质体）结合的成分。中药提取物不经分离直接与模拟生物膜结合，因而能够很好地阐明中药多成分、多靶点协同作用的特点。,董倩倩,李睿岩,李萍.丹参与脂质体模拟生物膜相互作用研究J.中国药学杂志,2007.,55,.,4.2脂质体平衡透析/液相色谱质谱联用方法,董倩倩,李睿岩,李萍.丹参与脂质体模拟生物膜相互作用研究J.中国药学杂志,2007.,适合中药复杂体系的效应物质基础研究，为中药活性成分的筛选提供了一种简便的模型。,活性检测,结构鉴定,成分分析,56,.,4.3细胞固相萃取/液相色谱质谱联用法,细胞固相萃取/液相色谱质谱联用法以活性细胞为分离载体，以中药提取物为对象，依据提取物中的成分与细胞是否具有特异亲和能力而分离。,57,.,4.3细胞固相萃取/液相色谱质谱联用法,李等人以内皮细胞为活性细胞，应用该技术对当归补血汤及其组分的总提取物进行了研究，结果显示：当归补血汤提取物中5个成分与内皮细胞具有特异性的相互作用，采用LC-MS技术和标准品对照的方法,鉴定这些成分中含有藁本内酯、毛蕊异黄酮等。,LiSL,LiP,ShengLH,etal.LivecellextractionandHPLC-MSanalysisforpredictingbioactivecomponentsoftraditionalChinesemedicinesJ.JPharmBiomedAnal,2006,41(2):576-581.,58,.,4.4微透析生物取