第七章 微生物遗传(复旦大学普通微生物学课件).ppt

第七章微生物的遗传变异和育种,微生物是遗传学研究的最好材料和对象模式生物,微生物结构简单,营养体一般都是单倍体,微生物繁殖速度快,存在多种方式的繁殖类型,环境条件对微生物作用直接均匀,易积累不同的代谢中间产物及代谢最终产物,微生物的变异易被识别,存在多种处于进化工程中、富有特色的原始有性生殖方式,遗传（heredityinheritance）：,亲代与子代相似,变异（variation）：,亲代与子代、子代间不同个体不完全相同,遗传（inheritance）和变异（variation）是生命的最本质特性之一,基本概念,种瓜得瓜，种豆得豆,遗传（heredity)：生物的亲代传递给其子代一套遗传信息的特性。遗传型（genotype)：又称基因型，指某一生物个体所含有的全部遗传因子即基因组所携带的遗传信息。遗传型是一种内在可能性或潜力，其实质是遗传物质上所负载的特定遗传信息。,表型（phenotype）：又称表现型，具有一定遗传型的个体，在特定环境条件下通过生长发育所表现出来的形态等生物学特征的总和。表型是一种现实性。,变异：指生物体在某种外因或内因的作用下所引起的遗传物质结构或数量的改变，亦即遗传型的改变。饰变：是指外表的修饰性改变，意即一种不涉及遗传物质结构改变而只发生在转录、转译水平上的表型变化。,变异特点：在群体中以极低几率(一般为10-510-10)出现；性状变化的幅度大；变化后的新性状是稳定和可遗传的。饰变特点：整个群体中每一个体都发生同样变化；性状变化的幅度小；饰变性状不遗传。,橘生淮南则为橘，生于淮北则为枳。,遗传的物质基础基因突变和诱变育种基因重组和杂交育种基因工程,内容提要,第一节遗传变异的物质基础,三个经典实验证明核酸是微生物遗传物质,转化实验,噬菌体感染实验,植物病毒的重建实验,遗传物质在微生物细胞内的存在部位和方式,朊病毒的发现与思考,亚病毒的一种：具有传染性的蛋白质致病因子，迄今为止尚为发现该蛋白内含有核酸。,其致病作用是由于动物体内正常的蛋白质PrPc改变折叠状态为PrPsc所致，而这二种蛋白质的一级结构并没有改变。,朊病毒的发现与思考,思考,1）蛋白质是否可以作为遗传物质？prion是生命的一个特例？还是仅仅为表达调控的一种形式？,2）蛋白质折叠与功能的关系，是否存在折叠密码？,DNARNA肽链蛋白质,复制,转录,翻译,遗传物质类型,核染色体：,核外染色体,真核生物细胞器(线粒体、叶绿体等）共生生物（卡巴颗粒）2um质粒,原核生物质粒,遗传物质在微生物细胞内的存在部位和方式,细胞水平（细胞核或核区，核（区）的数目如单核、多核）；核水平；染色体水平（数量、倍数ds、ss）；核酸水平（种类、结构、长度、大小）；基因水平；密码子水平（4种核苷酸按三联体排列有64个，决定20种氨基酸）；核苷酸水平(A、G、T、C；A、G、U、C）。,基因是一段DNA，具有自主复制能力的最小遗传单位,DNA就是脱氧核糖核酸（长链）,腺嘌呤（A）,鸟嘌呤（G）,胸腺嘧啶（T）,胞嘧啶（C）,A,T,C,G,A,A,A,T,T,T,T,T,T,A,A,A,G,G,G,G,G,C,C,C,C,C,G,C,基因测序就是读出A-C-G-T-G-G-A-C-G.,基因控制Pr因而控制性状,DNA,基因是什么？,基因决定生物体的生、长、病、老死等一切生命现象,基因是生命的密码。,基因记录和传递遗传信息。,原核生物的基因调控系统是由一个操纵子和它的调节基因所组成。每个操纵子包括3种功能上密切相关的基因：结构基因、操纵基因、启动基因。真核生物一般无操纵基因,基因调控系统,操纵子,结构基因,调节基因,启动基因（启动子）,操纵基因,结构基因：决定某一多肽链结构的DNA模板，通过转录和翻译来执行多肽链合成任务；,操纵基因：位于启动基因和结构基因之间的一段核苷酸序列，通过与阻遏物的结合与否，控制结构基因是否转录；,启动基因；一种依赖于DNA的RNA多聚酶所识别的核苷酸序列，既是DNA多聚酶的结合部位，优势转录的起始点。,真核生物的基因一般无操纵子结构。,大肠杆菌基因组,4100个基因，4.7106bp,遗传信息的连续性,共价、闭合、环状,功能相关的结构基因组成操纵子,结构基因单拷贝及rRNA多拷贝,基因的重复序列少而短,质粒原核生物遗传物质存在的一种方式,质粒：一种独立于染色体外，能进行自主复制的细胞质遗传因子，主要存在于各种微生物细胞中。,质粒不同于病毒不具有胞外形态，而仅以核酸的简单方式存在于细胞中,质粒上携带某些核基因组上所缺少的基因，使细菌等原核生物获得某些对其生存并非必不可少的特殊功能：如接合、产毒、产特殊酶、降解环境毒物等,cccDNA,ocDNA,lDNA,质粒的复制与核染色体的复制不同步，在这类细胞中，一般含1015个或更多质粒。,严紧型复制控制（stringentreplicationcontrol）,松弛型复制控制（relaxedreplicationcontrol）,质粒的复制与核染色体的复制同步，在这类细胞中，一般只含12个质粒；,质粒是一种独立存在于细胞内的复制子（replicon）,通常以共价闭合环状（covalentlyclosedcircle，简称CCC）的超螺旋双链DNA分子存在于细胞中；,也发现有线型双链DNA质粒和RNA质粒；,质粒分子的大小范围从1kb左右到1000kb；（细菌质粒多在10kb以内）,质粒的分子结构,提取所有胞内DNA后电镜观察；,超速离心或琼脂糖凝胶电泳后观察；,对于实验室常用菌，可用质粒所带的某些特点，如抗药性初步判断。,特定的质粒提取方法和后处理使染色体和RNA均被除掉。,质粒的检测,质粒的主要功能,在某些特殊条件下，质粒有时能赋予宿主细胞以特殊的机能，从而使宿主得到生长优势。,质粒所含的基因对宿主细胞一般是非必需的；,质粒所编码的功能和赋予宿主的表型效应,致育因子（Fertilityfactor，F因子）抗性因子（Resistancefactor，R因子）产细菌素的质粒（Bacteriocinproductionplasmid）毒性质粒（virulenceplasmid）代谢质粒（Metabolicplasmid）隐秘质粒（crypticplasmid）,质粒的主要类型,（1）F质粒（Fplasmid）,又称F因子、致育因子（fertilityfactor）或性因子（sexfactor），其大小约100kb，为cccDNA，这是最早发现的一种与大肠杆菌的有性生殖现象（接合作用）有关的质粒。,携带F质粒的菌株称为F+菌株（相当于雄性），无F质粒的菌株称为F-菌株（相当于雌性）。,携带F质粒菌株,含调节DNA复制和拷贝数的基因以及转移基因，相对分子量约11107，具有转移功能；,抗性转移因子（resistancetransferfactor，RTF）,抗性决定因子（r-determinant）,大小不固定，相对分子量从几百万至11108以上，无转移功能，含各种抗性基因，如抗青霉素、氨苄青霉素、氯霉素、链霉素和磺胺等基因。,R质粒一般由两个相连的DNA片段组成,（2）R质粒（Rplasmid）,称R因子（Rfactor）、抗性因子（resisitranceplasmid），包括抗药性和抗重金属二大类,（3）Col质粒（colicinplasmid，colplasmid）,又称大肠杆菌素质粒或产大肠杆菌素因子（colicinogenicfactor，colfactor）。,细菌素（bacteriocin）是质粒编码的蛋白质，一般由细菌产生，可抑制或杀死其他近缘细菌或同种不同菌株的代谢产物，但不具有很广的杀菌谱。,细菌素结构基因、涉及细菌素运输及发挥作用（processing）的蛋白质的基因、赋予宿主对该细菌素具有“免疫力”的相关产物的基因,一般都位于质粒或转座子上，细菌素可以杀死同种但不携带该质粒的菌株。,细菌素一般根据产生菌的种类进行命名：,大肠杆菌（E.coli）产生的细菌素为colicins（大肠杆菌素），而质粒被称为Col质粒。,ColE1质粒：相对分子量小（9kb，约5106），无接合作用，是松弛性控制、多拷贝的；Colb质粒：相对分子量大（94kb，约8107），具有通过接合而转移的功能，属严紧型控制，只有12个拷贝。,（4）Ti质粒（tumorinducingplasmid）,即诱癌质粒或冠瘿质粒（crowngallplasmid）。Ti质粒是一种200kb的环状质粒，包括毒性区（vir）、接合转移（con）、复制起始区（ori）和T-DNA区4部分。,T-DNA区可携带任何外源基因整合到植物基因组中，Ti质粒是植物基因工程中使用最广、效果最佳的克隆载体。,（5）mega质粒（megaplasmid）,即巨大质粒，其相对分子量比一般质粒大几十倍至几百倍，存在于Rhizobium（根瘤菌属）中，其上有一系列与共生固氮相关的基因。,（6）降解质粒,这类质粒是由降解一系列复杂有机物的酶编码，所以在污水处理、环境保护等方面发挥作用。,只在假单胞菌属（Pseudomonas）中发现降解质粒。,降解质粒以其所分解的底物命名，例如，CAM（樟脑）质粒，OCT（辛烷）质粒，XYL（二甲苯）质粒，SAL（水杨酸）质粒，MDL（扁桃酸）质粒，NAP（萘）质粒，TOL（甲苯）质粒等,“超级菌”通过遗传工程手段构建具有数种降解质粒的菌株，具有广谱降解能力的工程菌。,（一）转化实验,有荚膜菌落光滑分泌毒素致病,无荚膜菌落粗糙无毒不致病,实验材料：肺炎链球菌,最早进行转化（transformation）实验的是F.Griffith（1928年），他以Streptococcuspneumoniae（肺炎链球菌，旧称“肺炎双球菌”）作为研究对象。厚壁菌门-芽孢杆菌纲-乳杆菌目-乳杆菌科-链球菌属,R型活菌,1、动物实验,活的无毒（R）型细菌受到了死的有毒（S）型细菌的影响，转化为有毒（S）型,合理的解释：,（2）细菌培养实验,（3）S型菌的无细胞抽提液试验,以上实验说明：加热杀死的S型细菌细胞内可能存在一种转化物质，它能通过某种方式进入R型细胞并使R型细胞获得稳定的遗传性状，转变为S型细胞。,热死S菌不生长活R菌长出RII菌热死S菌长出大量R菌和10-6S菌,活R菌+S菌无细胞抽提液长出大量R菌和少量S菌,+活R菌,平皿培养,加热杀死的S型细菌，在其细胞内可能存在一种具有遗传转化能力的物质，能通过某种方式进入R型细胞，并使R型细菌获得表达S型细菌荚膜性状的遗传特性。,以上实验说明：,（1）从活的S菌中抽提各种细胞成分（DNA，蛋白质，荚膜多糖等）（2）对各组分进行转化试验,Avery在四十年代以更精密的实验设计重复了以上实验,1953年美国人Hershey和Chase用放射性同位素方法，提供了DNA是噬菌体遗传物质的直接证据。用含32P和35S的培养基培养大肠杆菌H，再用被标记的大肠杆菌培养2噬菌体，直至完全标记上32P和35S的T2噬菌体为止。用标记的T2噬菌体侵染没有标记的大肠杆菌，结果表明，2噬菌体外壳蛋白中有35S放射性并与细菌的细胞壁连接，而DNA部分则有32P放射性并进如细菌的细胞质中。这一事实说明，在噬菌体侵染细菌过程中蛋白质外壳留在细菌细胞外，只有DNA进入了细胞，又一次证明遗传物质是DNA，而不是蛋白质。,（二）噬菌体的感染实验,32P标记核酸35S标记蛋白,32PDNA核心的噬菌体,35S蛋白质外壳的噬菌体,在DNA中存在着包括合成蛋白质外壳在内的整套遗传信息。,（三）病毒拆开和重建实验,烟草花叶病毒的核酸,抗血清处理，证明杂种病毒的蛋白质外壳来自病毒1，而非病毒2,杂种病毒的后代的蛋白质外壳表现为病毒2，而非病毒1,遗传物质是核酸（RNA）而非蛋白质,霍氏车前病毒的蛋白质外壳,HRV,TMV,霍氏车前病毒,烟草花叶病毒,(1)用表面活性剂处理标准TMV，得到它的蛋白质；(2)从TMV的变种HRV通过弱碱处理得到它的RNA；(3)通过重建获得杂种病毒；(4)证实杂种病毒的蛋白质外壳是来自TMV标准株。(5)杂种病毒感染烟草产生HR所特有的病斑，说明杂种病毒的感染特性是由HR的RNA所决定，而不是二者的融合特征(6)从病斑中一再分离得到的子病毒的蛋白质外壳是HR蛋白质，而不是标准株的蛋白质外壳。以上实验结果说明杂种病毒的感染特征和蛋白质的特性是由它的RNA所决定，而不是由蛋白质所决定，遗传物质是RNA。,病毒拆开和重建实验证明了RNA是遗传物质,基因突变,突变与育种,第二节基因突变和诱变育种,基因突变：又称点突变，DNA链上的一对突变或少数几对碱基发生改变。(碱基置换、移码突变)染色体畸变：DNA的大段变化(损伤)现象(添加、缺失、易位、倒位)基因重组：把两个不同性状个体内的遗传基因转移到一起，经过遗传分子的重新组合后，形成新遗传型个体的方式，称为基因重组(原核生物、真核生物),遗传性变异,一、基因突变,基因突变：指细胞内（或病毒粒内）遗传物质的分子结构或数量突然发生的可遗传的变化，简称突变，狭义的突变专指基因突变，广义的突变包括基因突变和染色体畸变。,野生型菌株：从自然界分离到的菌株。突变株：突变体、突变型。野生型经突变后形成的带有新性状的菌株。,（一）微生物突变体的主要类型,形态突变型,菌落形态突变型,菌体形态突变型,生化突变型,营养突变体(营养缺陷型),发酵突变体,抗性突变体,条件致死突变体,抗原突变型,产量突变型,按突变实质分,条件致死突变型（株）,按突变株的表型,选择性突变株,非选择性突变株,营养缺陷型（株）,抗性缺陷型（株）,形态突变型（株）,抗原突变型（株）,产量突变型（株）,按方法分,按突变株的表型是否能在选择性培养基上加以鉴别来分,（1）营养缺陷型：某一野生菌株因发生基因突变而丧失合成一种或几种生长因子、碱基或氨基酸的能力，因而无法再在基本培养基上正常生长繁殖的变异类型。（2）抗性突变型：指野生型菌株因发生基因突变，而产生的对某化学药物或致死物理因子的抗性变异类型。（3）条件致死突变型：某菌株或病毒经基因突变后，在某种条件下可正常地生长、繁殖并呈现其固有的表型，而在另一条件下却无法生长、繁殖，这种突变类型称为,（4）形态突变型：指由突变引起的个体或菌落形态的变异，一般属非选择性突变。（5）抗原突变型：指由于基因突变引起的细胞抗原结构发生的变异类型，包括细胞壁缺陷变异、荚膜或鞭毛成分变异等。（6）产量突变型：通过基因突变而产生的在代谢产物产量上明显有别于原始菌株的突变株，称产量突变型。,（二）突变率,突变率：某一细胞（或病毒粒）在每一世代中发生某一性状突变的几率。一般为10-610-9，转座突变率为10-4。,(三)突变的特点,不对应性：突变形状与引起突变原因之间无对应关系；,自发性：可以自发产生突变；,稀有性：自发突变几率极低，在10-610-9之间；,独立性：某基因的突变率不受其它基因突变率的影响；,可诱变性：（提高10105倍）,稳定性：新遗传性状的稳定性；,可逆性：回复突变,变量试验,涂布试验,影印培养试验,（四）基因突变自发性和不对应性的证明,(在同一个大管中作整体培养),10107.15443.5,抗噬菌体菌落数抗噬菌体菌落数,变量试验根据统计学原理设计（1943年）,涂T1噬菌体平板,涂T1噬菌体平板,结果表明：来自甲管的50皿中,各皿间抗性菌落数相差极大(图左),而来自乙管的则各皿数目基本相同(图右)。原因分析：E.coli抗噬菌体性状的突变,不是由所抗的环境因素噬菌体诱导出来的,而是在它接触到噬菌体前,在某一次细胞分裂过程中随机地自发产生的。这一自发突变发生得越早,则抗性菌落出现得越多,反之则越少,噬菌体在这里仅起着淘汰原始的未突变的敏感菌和鉴别抗噬菌体突变型的作用。,TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1969,涂布试验(Newcombe,1949),实验结果：在涂布过的一组中,共有抗性菌落353个,要比未经涂布过的(仅28个菌落)高得多。原因分析：该抗性突变发生在未接触噬菌体前。噬菌体的加入只起甄别这类突变是否发生的作用，而不是诱导突变的因素。,影印培养试验(J.Lederberg,1952),1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,由此可知：原始的链霉素敏感菌株只通过(1)(2)(4)(5)(6)(8)(9)(10)(12)的移种和选择序列,就可在根本未接触链霉素的情况下,筛选出大量的抗链霉素的菌株。,J.LederbergisawardedtheNoblePrizeinMedicineandPhysiologyin1958,（五）基因突变及机制,基因突变机制多种，可是自发的或诱发的。诱发突变包括影响一对基因的点突变和影响一段染色体的畸变。,1、诱发突变：通过人为的方法，利用物理、化学或生物因素显著提高基因突变频率的手段。,2）诱发突变机制,（1）碱基置换（substitution)（2）移码突变(frame-shiftmutation)（3）染色体畸变（Chromosomalaberration),碱基的置换,转换（transition）,颠换（transversion）,一个嘌呤,另一个嘌呤,一个嘧啶,另一个嘧啶,一个嘌呤,另一个嘌呤,一个嘧啶,另一个嘧啶,碱基的置换：一对碱基被另一对碱基置换,直接引起置换的诱变剂,HNO2，羟胺，各种烷化剂,间接引起置换的诱变剂,碱基的置换,T：烯醇式,碱基类似物,移码突变（frame-shiftmutation，phase-shiftmutation）,指诱变剂使DNA序列中的一个或少数几个核苷酸发生增添（插入）或缺失，从而使其后面的全部遗传密码发生阅读框发生改变，并进一步引起转录和转译错误的一类突变。,移码突变,分子中缺失或增加少数几个碱基对而引起,造成突变点以后全部遗传密码转录与转释发生错误,增添一个碱基,缺少一个碱基,丫啶类染料、ICR化合物,染色体畸变（chromosomalaberration）,电离辐射（X射线等）烷化剂亚硝酸等,某些强烈理化因子,引起,点突变,DNA的大损伤（macrolesion）,DNA的大损伤（macrolesion）,染色体畸变,缺失（deletion）,重复（duplication）,插入（insertion）,易位（translocation）,倒位（inversion）,染色体结构上,染色体数目的变化,转座（transposition）：DNA序列通过非同源重组的方式，从染色体某一部位转移到同一染色体上另一部位或其他染色体上某一部位的现象。,凡具有转座作用的一段DNA序列，称转座因子（transposibleelement，TE），又称跳跃基因（jumpinggene）、可移动基因（moveablegene）、可移动遗传因子（mobilegeneticelement）。,转座因子,插入序列（insertionsequence，IS）,转座子（transposon，Tn）,Mu噬菌体（mutatorphage）,转座噬菌体（transposablephage）,原核生物,E.coli,转座因子的特点,在转座时，通过转座因子的复制，可将新形成的拷贝以非同源重组的方式转移到染色体的新部位上；在转座因子两端各有一段一定长度的末端重复序列，包括正向重复（directrepeat）和反向重复（invertedrepeat，或颠倒重复）；每个转座因子还带有一个对转座有特异功能的转座酶基因（transposasegene）。,紫外线诱变作用机理,可使链裂断，破坏核糖和磷酸间的键联,引起胞嘧啶和尿嘧啶产生水合作用造成氢键断裂,能使胸腺嘧啶成二聚体，使结构发生改变,把经UV照射后的微生物立即暴露于可见光下时，可明显降低其死亡率的现象，称为光复活作用。,光复活作用（photoreactivation，photorestoration）,最早是A.Kelner（1949）在Streptomycesgriseus（灰色链霉菌）中发现的。后来，在许多微生物中都得到了证实。,最明显的是在E.coli的实验对照：8106个mLE.coli100个mLE.coli试验：8106个mLE.coli2106个mLE.coli,UV,UV,360490nm,可见光，30min,使二聚体（dimer）重新分解成单体（monomer）,带有嘧啶二聚体的DNA分子,DNA分子,UV照射,黑暗下结合,光激活酶光解酶（光裂合酶，photolyase）,复合物,300500nm可见光获得光能而激活,释放光解酶,在一般的微生物中都存在光复活作用，在利用UV进行诱变育种等工作时，应在红光下进行照射和后续操作，并放置在黑暗条件下培养。,注意,突变与育种,自发突变与育种,从生产中选育,定向培育优良品种,诱变育种,诱变育种的基本环节,诱变育种的原则,诱变育种：是指用物理或化学诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群，在促进其突变频率显著提高的基础上，从中挑选少数符合目的的突变株，以供科学实验或生产实践使用。,筛选,诱变,诱变育种,定向的更重要,随机的,诱变育种的特点,（1）提高突变率，扩大突变谱（2）有效地改良个别、单一性状（3）缩短育种年限（4）定向变异和有益突变的频率低,1、诱变育种的过程,（1）选择合适的出发菌株（2）制备待处理的菌悬液（3）诱变处理（4）筛选（5）保藏和扩大试验,诱变育种的基本环节,出发菌株,纯化、同步培养,培养液,离心收集细胞，洗涤，制菌悬液玻璃珠打散，过滤,细胞或孢子悬液,诱变处理,平板分离,初筛,复筛,保藏及扩大试验,活菌计数，诱变预备试验,存活细胞计数，致死率计算,变异率计算,诱变育种工作中应考虑的几个原则,选优良的出发菌株,选择简便有效的诱变剂,处理单孢子（或单细胞）悬液,选用最适剂量,设计或采用高效筛选方案或方法,利用复合处理的协同效应,利用和创造形态，生理与产量间的相关指标,选择简便有效的诱变剂:紫外线、亚硝基胍,选择优良突变株,艾姆氏试验：是一种利用细菌营养缺陷型的回复突变来检测环境或食品中是否存在化学致癌剂的简便有效方法。具体操作：检测鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphmurium)组氨酸营养缺陷型菌株(his-)的回复突变率。回复突变：突变体失去的野生型性状，可以通过第二次突变得到恢复，这种第二次突变称为回复突变。,Ames试验：BruceAmes教授于1966年发明,利用回变检测致癌剂艾姆斯试验法,平板上无大量菌落产生，说明试样中不含有诱变剂,平板周围有抑制圈，外周出现大量菌落，说明试样中含有某种高浓度的诱变剂,平板周围有大量菌落，说明试样中含有浓度适当的诱变剂,3类突变株的筛选方法1）产量突变株的筛选2）抗药性突变株的筛选3）营养缺陷型突变株的筛选,此法的关键是用打孔器取出含有一个小菌落的琼脂块作分别培养。这样，各琼脂块所含养料和接触空气面积基本相同，且产生的抗生素等代谢产物不致扩散出琼脂块外。,产量突变株的筛选,抗药性突变株的筛选,基因突变使菌株对某种或某几种药物，特别是抗生素，产生抗性。,特点：,正选择标记突变株可直接从抗性平板上获得-在加有相应抗生素的平板上，只有抗性突变能生长。所以很容易分离得到。,梯度平板法（gradientplate）是定向筛选抗药性突变株的一种有效方法，通过制备琼脂表面存在药物浓度梯度的平板、在其上涂布诱变处理后的细胞悬液、经培养后再从其上选取抗药性菌落等步骤，就可定向筛选到相应抗药性突变株。,营养缺陷型筛选的四个环节,诱变剂处理淘汰野生型检出缺陷型鉴定缺陷型,基本培养基（MM符号为-）：仅能满足某微生物的野生型菌株生长所需要的最低成分的组合培养基，称基本培养基。完全培养基（CM符号为+）：凡可满足一切营养缺陷型菌株营养需要的天然或半组合培养基，称完全培养基。补充培养基（SM，符号为A或B）：凡只能满足相应的营养缺陷突变株生长需要的组合或半组合培养基称补充培养基。,野生型：指从自然界分离到的任何微生物在其发生人为营养缺陷型的原始菌株A+B+。营养缺陷型：野生型菌株经诱变剂处理后，由于发生了丧失某酶合成能力的突变，因而只能在加有该酶合成产物的培养基中才能生长，这类突变菌株称为营养缺陷型，A-、B-。原养型：一般指营养缺陷型突变株经回复突变或重组后产生的菌株，其营养要求在表型上与野生型相同A+B+。,诱变剂处理,目前在实践上常用的诱变剂主要有：紫外线氮芥硫酸二乙酯N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍（NTG或MNNG）亚硝基甲基脲（NMU）后两种因为有突出的诱变效果，所以被誉为“超诱变剂”。,淘汰野生型,在诱变后的存活个体中，营养缺陷型的比例一般较低，通常只有百分之几至千分之几。通过抗生素法（青霉素法用于细菌，制霉菌素法用于真菌）和菌丝过滤法淘汰为数众多的野生型菌株，从而达到了“浓缩”营养缺陷型的目的。,检出缺陷型,同一培养皿平板上检出：夹层培养法限量补充培养法。不同培养皿上分别进行对照和检出：逐个检出法影印接种法。,基因重组和杂交育种,包括有性杂交、准性杂交、原生质体融合、遗传转化及原核生物中的转化、转导、接合和原生质体融合。,凡把两个不同性状个体内的遗传基因转移到一起，经过遗传分子间的重新组合，形成新遗传型个体的方式，称为基因重组（generecombination）或遗传重组（geneticrecombination），简称重组。,位点专一性重组同源重组转座重组不正常重组,细胞水平的杂交包含分子水平上的重组。,基因重组是杂交育种的理论基础，在方向性还是自觉性方面，比诱变育种前进了一大步，且可消除某一菌株在经过长期诱变处理后所出现的产量上升缓慢的现象，是一种重要的育种手段。,同源序列：碱基序列相似的两段DNA序列；同源重组：两个具有同源序列的DNA之间发生相互性或非相互性交换重组；同源重组过程：DNA解链、单链断裂、配对、重接形成异源双链区，然后经DNA复制而纯化；,配对,重接,断裂,异源双链,解链,断裂,同源重组的过程,有性繁殖期间，两个性细胞质配、核配形成二倍体合子，此时，亲代的两个染色体相遇，并发生一定频率的基因重组，使减数分裂产生的子代的基因组具有亲代的特性；基因重组在具有性繁殖的生物中是普遍存在的现象，有利于基因多样性。,有性繁殖与同源重组,原核生物的基因重组,原核生物缺乏有性繁殖，基因重组并不普遍存在。相对频繁的基因突变，是基因多样性的来源；原核生物中存在几种特殊的基因水平转移方式：转化、转导、接合；在一定条件下，这几种基因水平转移方式，能够导致原核生物之间发生基因重组；通过上述方式发生基因重组，而形成的具有新的基因型的细胞，称为重组子；,原核生物的基因重组,通过转化、接合、转导等形式进行一部分物质转移和基因重组。,特点：片段性：仅一小段DNA序列参与重组；单向性：即从供体菌向受体菌（或从供体基因组向受体基因组）作单方向转移；转移机制独特而多样：如接合、转化和转导、原生质体融合等。,1、转化(transformation),受体细胞直接吸收了来自供体细胞的DNA片断，并把它整合到自己的基因组中，细胞部分遗传性状发生变化的现象叫转化。通过转化而形成的杂种后代称转化子。,转化现象的发现是生物学上的一个杰出事件，不再怀疑DNA是遗传物质。,转化微生物的种类多,原核生物Streptococcuspneumoniae（肺炎链球菌）Haemophilus（嗜血杆菌属）Bacillus（芽孢杆菌属）Neisseria（奈瑟氏球菌属）Rhizobium（根瘤菌属）Staphylococcus（葡萄球菌属）Pseudomonas（假单胞菌属）Xanthomonas（黄单胞菌属）等。,真核微生物Saccharomycescerevisiae（酿酒酵母）、Neu-rosporacrassa（粗糙脉孢菌）、Aspergillusniger（黑曲霉）等。,（1）转化因子,转化是游离的片断的转移和重组；,游离的片断叫转化因子；,转化因子由供体提供；,自然情况下可由细菌细胞自行裂解产生，实验室里通过提取获得；,dsDNA和ssDNA都具有转化能力，但只有ssDNA才能进入细胞内。,转化因子的本质是离体的DNA片段。一般只有15kb左右。,质粒DNA是良好的转化因子，但通常不能与核染色体发生重组。,受体细胞能接受转化的生理状态称为感受态,（2）感受态,感受态出现原因：,细菌失去部分细胞壁的结果；细菌在细胞表面产生某种酶引起,只有处于感受态的细菌才能接受转化因子。微生物不同，出现的时间不同，持续的时间也不同。,有些出现在指数期的后期，有些出现在指数期末和稳定期,感受态的决定因素,细胞遗传性决定,和菌龄有关,环腺苷酸Camp可提高1000倍,Ca2+能促使细胞进入感受态,感受态因子调节感受态的一种特异蛋白,是受体细胞表面上的一种蛋白质,功能：使转化因子结合在受体细胞表面,感受态细胞吸收外源DNA进入细胞，而发生基因重组的过程；通过转化而形成的重组子，也称为转化子（transformant）,转化过程,感受态细胞（competencecell）：某些微生物在特定环境条件下出现的，能够将胞外DNA片段吸收进入细胞的一种特殊生理状态；,转化过程,供体(strR),dsDNA,感受态受体(strS),酶解与吸收ssDNA,同源区段配对,单链整合,复制与分解,转化子(strR),非转化子(strs),转化的特点：不需两个细胞直接接触，供体DNA提取出来，注入受体即可。,感受态细胞吸收DNA的特点：小于15kb的DNA片段和质粒可以被感受态细胞吸收；G-细菌可以吸收dsDNA，然后在胞内降解为ssDNA；G+细菌在胞外先将dsDNA降解为ssDNA，然后再吸收进入细胞；,转染：指用提纯的病毒核酸，用转化的方式转入宿主细胞或其原生质体，可增殖出一群正常病毒后代的现象。,转染与广义的转化,噬菌体DNA被感受态细胞摄取并产生有活性的病毒颗粒,现在把DNA转移至动物细胞的过程也称转染,特点：提纯的噬菌体DNA以转化的（而非感染）途径进入细胞并表达后产生完整的病毒颗粒。,广义的转化：将游离DNA片段或质粒转入受体细胞的技术手段，是基因工程的基本方法之一。人工感受态转化原生质体转化电转化：击穿细胞壁和细胞膜,转导的种类,供体遗传物质通过噬菌体的携带而转移到受体的基因重组。,2、转导(transduction),转导子：由转导作用而获得部分新性状的重组细胞。,特点：需要噬菌体做媒介，不需要细胞间直接接触,由噬菌体介导的细菌细胞间进行遗传交换的一种方式：一个细胞的DNA通过病毒载体的感染转移到另一个细胞中,能将一个细菌宿主的部分染色体或质粒DNA带到另一个细菌的噬菌体称为转导噬菌体。,普遍转导：通过极少数完全缺陷噬菌体对供体菌基因组上任何小片段DNA进行“误包”，而将其遗传性状传递给受体菌的现象。一般用温和噬菌体作为普遍转导的媒介。,流产普遍转导（abortivetransduction），简称流产转导，经转导嗜菌体的媒介而获得了供体菌DNA片段的受体菌，外源DNA在其内既不进行交换、整合和复制，也不迅速消失，而仅进行转录、转译和性状表达，这种现象就称流产转导。,局限转导：通过部分缺陷温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中，并与后者的基因组整合、重组、形成转导子的现象。,只局限于传递供体菌核染色体上的个别特定基因，一般为噬菌体整合位点两侧的基因；该特定基因由部分缺陷的温和噬菌体携带；缺陷噬菌体的形成方式是由于它在脱离宿主染色体过程中，发生低频率（10-5）“误切”（不正常切离，abnormalexcesion）或由于双重溶源菌的裂解而形成；局限转导噬菌体的产生要通过UV等因素对溶源菌的诱导并引起裂解后才产生。,完全缺陷型噬菌体的形成,子代噬菌体在宿主细胞内装配时，因“误切”和“误包”而将宿主的DNA片段装进噬菌体衣壳，形成只含宿主DNA片段的完全缺陷型噬菌体；,完全缺陷型噬菌体既可以由烈性噬菌体形成，也可由温和性噬菌体形成，自然形成几率约10-610-8；,部分缺陷型噬菌体的形成,整合在溶源化细胞染色体上的原噬菌体，去整合化时可能发生“误切”，自身部分DNA与旁侧的染色体发生了交换而切割下来，形成部分缺陷的噬菌体核酸；部分缺陷的噬菌体核酸仍然能够正常复制和基因表达，并装配、裂解宿主细胞，产生部分缺陷型的子代噬菌体；几率低于10-6；,完全普遍性转导(compietetransduction),A-B+色氨酸缺陷型,A+B-组氨酸缺陷型,鼠伤寒沙门氏菌,噬菌体DNA不接合到寄主染色体；噬菌体蛋白质包裹寄主任何一部分DNA片段。,噬菌体DNA整合到寄主染色体上；噬菌体DNA与寄主染色体特定基因发生交换。,普遍性转导,局限性转导,普遍性转导的其它结果,如果由完全缺陷型噬菌体转入的供体菌DNA片段，没有发生基因重组，而被受体菌降解，则称为为转导失败；如果转入的DNA片段不能与宿主染色体发生基因重组，也没有被降解，而是存在于受体菌中，称为流产转导；,溶源转变,温和噬菌体并不携带外源供体菌的基因,这种温和噬菌体是完整的，而不是缺陷的,获得新性状的是溶源化的宿主细胞，而不是转导子,获得的性状可随噬菌体的消失而同时消失,正常的温和噬菌体感染其宿主而使其发生溶源化时，因噬菌体的基因整合到宿主核基因组上，而使宿主获得了除免疫性外的新遗传性状的现象，称溶源转变。,一个与转导相似又不同的现象,溶源转变与转导