液相色谱-质谱联用仪的原理及应用

1,液相色谱-质谱联用仪的原理及应用,福州大学测试中心冯蕊,2,色谱-质谱联用仪,色谱的分离能力,质谱的定性功能,实现对复杂混合物更准确的定量和定性分析。而且也简化了样品的前处理过程，使样品分析更简便。,3,色谱质谱联用的接口,接口：是将色谱仪与质谱仪直接联接起来的装置。作用：将通过色谱仪分离开的各种组分逐一送入质谱仪中进行分析。接口要协调前后两种仪器的输出和输入间的矛盾。将两种仪器的分析方法结合起来，协同作用，取长补短，获得单独使用时所不具备的功能。因此，接口是色谱质谱联用技术中的关键装置。,4,色谱质谱联用的分类,气相色谱-质谱联用：开发最早的色谱联用仪器，适宜分析小分子、易挥发、热稳定、能气化的化合物。液相色谱-质谱联用：液相色谱-质谱联用的接口问题得到解决，近年有了飞速发展。适宜分析大分子（包括蛋白、多肽多聚物等）、不挥发、热不稳定、极性的化合物。毛细管电泳-质谱联用：近年发展迅速，特别对生物大分子的分类分析十分有用。,5,质谱仪包括真空系统、进样系统、离子源、质量分析器、检测器和数据处理系统。,真空系统VacuumSystem,进样系统SampleInlet,检测器Detector,数据处理系统DataSystem,质量分析器MassAnalyser,离子源IonizationSource,质谱仪,6,质谱仪的离子源、质量分析器和检测器必须处于高真空状态。若真空度过低，则会造成离子源灯丝损坏、本底增高、图谱复杂化、干扰离子源的调节、加速极放电等问题。一般质谱仪都采用机械真空泵（前级低真空泵）预抽真空，再用高效率油扩散泵或分子涡轮泵（高真空泵）连续地运行以保持真空。只有在足够高的真空下，离子才能从离子源到达检测器，真空度不够则灵敏度低。,真空系统,7,进样系统是将分析样品引入到离子源的装置。进样方式：1直接进样2仪器联用的进样（GC、LC、CE）,进样系统,8,色谱-质谱联用仪的接口和色谱仪组成了质谱的进样系统。接口应满足：1.接口的存在既不破坏离子源的高真空，也不影响色谱柱的分离柱效；2.接口应能使色谱分离后的各组分尽可能多的进入质谱仪的离子源，同时使色谱流动相尽可能的不进入质谱的离子源；3.接口的存在不改变色谱分离后各组分的组成和结构。,仪器联用的进样,9,离子源将欲分析样品的原子或分子电离，得到带电离子，并对离子进行加速使其进入质量分析器。根据电离方式的不同，常用的有:,离子源,电子轰击电离源electronimpactionizationsource,EI化学电离源chemicalionizationsource,CI快原子轰击电离源fastatombombardmentsource,FAB电喷雾电离源electrosprayionizationsource,ESI大气压化学电离源atmosphericpressurechemicalionizationsource,APCI基质辅助激光解析电离源Matrix-AssistedLaserDesorptionIonization,MALDI,10,EI源应用最为广泛，特别是气相色谱-质谱联用仪中应用最多的离子源，它主要用于挥发性样品的电离。原理：由进样系统进入的气体样品到达离子源，与灯丝发出的电子发生碰撞使样品分子电离。,电子轰击电离源EI,电子轰击电离源示意图,11,特点：谱图简单，最强峰为分子离子峰和准分子离子峰，碎片离子峰很少。可用于负离子质谱，多数有机化合物的负离子CI质谱图灵敏度要比其正离子的CI质谱图高2-3个数量级。不适用难挥发试样。,化学电离源CI,CI源原理：利用反应气体的离子和样品分子发生分子-离子反应而生成样品分子离子。,化学电离源示意图,12,快原子轰击电离源FAB,FAB源原理：氩气被电子轰击而电离，生成的氩离子被电子透镜聚焦并加速生成动能可控的离子束，经过中和器中和掉离子束所带的电荷，成为高速定向运动的中性原子束，用此原子束轰击样品使其电离。,特点：适用于分析大分子量、难气化、热稳定性差的样品。,快原子轰击电离源示意图,13,特点：1.是一种软电离方式，适于分析极性强的有机化合物。2.容易形成多电荷离子，可以测量大分子量的蛋白质。3.主要应用于液相色谱-质谱联用仪。,电喷雾电离源ESI,ESI源原理：流出液在高电场下形成带电喷雾，在电场力作用下穿过气帘；从而雾化、蒸发溶剂、阻止中性溶剂分子进入后端检测。,电喷雾电离源示意图,14,大气压化学电离源APCI,APCI源原理：喷嘴下游放置一个针状放电电极，进行高压放电，使空气中某些中性分子电离，产生H3O+，N2+，O2+和O+等离子，溶剂分子也会被电离，这些离子与样品分子进行离子-分子反应，使样品分子离子化。,特点：属于“软”电离方式，适于分析质量数小于2000u的弱极性小分子化合物。只产生单电荷离子，主要是准分子离子，很少有碎片离子。主要应用于液相色谱-质谱联用仪。,大气压化学电离源示意图,15,MALDI适用于生物大分子，如肽类，核酸类化合物。可得到准分子离子峰，碎片离子和多电荷离子较少.,基质辅助激光解析电离源MALDI,MALDI源原理：待测物质的溶液与基质的溶液混合后蒸发，使分析物与基质成为晶体或半晶体，用一定波长的脉冲式激光进行照射时，基质分子能有效的吸收激光的能量，使基质分子和样品分子进入气相并得到电离。,基质辅助激光解析电离源示意图,16,质量分析器是质谱仪的核心,质量分析器的作用是将离子源产生的离子按m/z顺序进行分离并排列。,常用的质量分析器有：磁质量分析器（MagneticSectorAnalyzer）四极杆质量分析器（quadrupolemassanalyzer）飞行时间质量分析器（timeofflight,TOF）离子阱质量分析器（iontrap）,质量分析器,17,磁质量分析器是根据离子束在一定场强的磁场中运动时，其运动的曲率半径与离子的质荷比和加速电压有关。是质谱仪中最早使用的质量分析器。分为单聚焦磁质量分析器和双聚焦磁质量分析器。,磁质量分析器,单聚焦磁质量分析器示意图,双聚焦磁质量分析器示意图,特点：单聚焦磁质量分析器分辨率低，双聚焦磁质量分析器分辨率很高。,18,传统的四极杆质量分析器是由四根笔直的棒状电极与轴线平行并等距离的置悬着构成，棒的理想表面为双曲面。在一定DC/VC作用下，只有m/z满足一定要求的离子才能通过四极杆到达检测器，其他离子被滤掉。,四极杆质量分析器,四极杆质量分析器具有重量轻、体积小、造价低廉等优点。,四极杆质量分析器示意图,19,用一个脉冲将离子源中的离子瞬间引出，经加速电压加速，它们具有相同的动能进入漂移管，质荷比小的离子具有最快的速度因而首先到达检测器，质荷比大的离子则最后到达检测器。,配离子反射镜的飞行时间质谱示意图,飞行时间质量分析器,特点：1）检测离子的质荷比范围非常宽；2）灵敏度高，适合于作串联质谱的第二级；3）扫描速度快，适合研究极快过程。,20,离子阱与四极质量分析器的原理类似，当高频电压幅值和高频电压频率固定为某一值时，只能使某一质荷比的离子在阱内一定轨道上稳定旋转，改变端电极电压，不同m/z离子飞出阱到达检测器。,离子阱质量分析器,特点：单一的离子阱可实现多极“时间上”的串联质谱；结构简单、价格便宜，性价比高；灵敏度高；质量范围大。,21,检测器,质谱仪常用的检测器有直接电检测器、电子倍增器、闪烁检测器和微通道板等。电子倍增器运用质量分析器出来的离子轰击电子倍增管的阴极表面，使其发射出二次电子，再用二次电子依次轰击一系列电极，使二次电子获得不断倍增，最后由阳极接受电子流，使离子束信号得到放大。,电子倍增器示意图,22,数据处理系统,质谱仪都配有完善的计算机系统，不仅能快速准确的采集数据和处理数据，而且能监控质谱仪各单元的工作状态，实现质谱仪的全自动操作，并能代替人工进行化合物的定性和定量分析。,23,质谱谱图,质谱图：以检测器检测到的离子信号强度为纵坐标，离子质荷比为横坐标所作的图就是质谱图。质荷比：离子质量（以相对原子量单位计）与它所带电荷（以电子电量为单位计）的比值，写作m/z。峰：质谱图中的离子信号通常称为离子峰或简称峰。离子丰度：检测器检测到的离子信号强度。基峰：在质谱图中，指定质荷比范围内强度最大的离子峰称作基峰。,24,质谱谱图,25,分子离子：样品分子失去一个电子而形成的单电荷离子，它代表样品的分子量。准分子离子：指与分子存在简单关系的离子，通过它也可以确定分子量。液质中最常见的准分子离子峰是M+H+，M-H，M+Na+等。碎片离子：分子离子或准分子离子裂解生成碎片离子，碎片离子还可能进一步裂解成质量更小的碎片离子，碎片离子是解析质谱图，推断分子结构的重要信息。,质谱中的离子,26,质谱中的离子,母离子与子离子：任何一个离子进一步裂解为质荷比较小的离子，前者是后者的母离子或前体离子，后者是前者的子离子。同位素离子：由元素的重同位素构成的离子。各种元素的同位素基本上按照其在自然界的丰度比出现在质谱中，有利于确定化合物及碎片的元素组成。亚稳离子：由离子源到检测器的飞行途中裂解的离子。可以指示离子产生的途径，对结构判断很有用。,27,质谱中的离子,单电荷离子：带有1个电荷的离子，z=1。多电荷离子：带有2个或更多电荷的离子，如z2。奇电子离子（OE）：带未成对电子的离子，以符号“+”表示。偶电子离子（EE）：外层电子完全成对的离子，以符号“+”表示。,28,液相色谱-质谱联用,液相色谱-质谱（LC-MS）联用技术的研究开始于20世纪70年代，直到90年代才出现被广泛接受的商品接口及成套仪器。,液相色谱一般在常压下工作,除了真空匹配之外，液质联机技术发展可以说就是接口技术的发展。,质谱的工作要求高真空系统,LC-MS联用首先要解决的问题是真空的匹配。,29,液相色谱-质谱联用接口的发展,20世纪70年代直接液体导入接口（DLI）移动带技术（MB）20世纪80年代热喷雾接口（TS）粒子束接口（PB）快原子轰击接口（FAB）20世纪90年代基质辅助激光解析接口（MALDI）电喷雾电离接口（ESI）大气压化学电离接口（APCI）,30,DLI：是在真空泵的承载范围内，以细小的液流直接导入质谱。优点：是液质方法的最简单的接口，造价低廉。缺点：无法在大流量下工作；喷口易堵塞。,直接液体导入接口DLI,此方法始终停留在实验室使用阶段，没有真正形成商品化仪器。,31,MB：是在LC柱后增加一个传送带，柱后流出物滴落在传送带上，经红外线加热除去大部分溶剂后进入真空室，传送带依据流动相的组成调整移动速度。优点：基于溶剂和样品的沸点差别进行分离，可被用于大部分有机物的质谱分析。缺点：不适于分析高沸点、难挥发的化合物；离子化效率低；灵敏度低；移动带上残存的难挥发物质易造成记忆效应而干扰分析。,移动带技术MB,32,TS：喷雾探针取代直接进样杆，流动相经过喷雾针时被加热到低于完全蒸发点5-10，体积膨胀后以超声速喷出探针形成雾状混合物。优点：可适应较大流速和含水较多的液相流动相。缺点：分子量局限于200-1000u的化合物；对热稳定性较差的化合物有比较明显的分解作用。,热喷雾接口TS,33,FB：又称动量分离器。流动相及样品被喷雾成气溶胶，脱去溶剂后在动量分离器内产生动量分离，而后经一根加热的转移管进入质谱。优点：离子化由质谱的EI或CI方式进行，可以获得经典的质谱图。缺点：由于离子化手段仍为电子轰击，不是软离子化方式，因此不适于分析热不稳定化合物；主要用于分析非极性或中等极性的、分子量小于1000u的化合物。,粒子束接口FB,34,FAB：快原子轰击电离源优点：是“冷”离子源，适于分析热不稳定、难气化的化合物，尤其是对肽类和蛋白质分析的有效性在电喷雾接口出现前是其它接口无法相比的。缺点：混合物样品中共存物质干扰抑制样品分子的离子化，造成灵敏度下降；只能在低流量下工作，严重限制了液相柱的分离效果。,快原子轰击FAB,35,基质辅助激光解析MALDI,MALDI：基质辅助激光解析电离源优点：特别适合与飞行时间质谱联用，可测分子量范围高达上百万u，并且具有很高的灵敏度。缺点：与FAB相同，混合物样品中共存物质的干扰也很明显，造成质谱信号很弱或根本没有，灵敏度下降。,36,电喷雾电离ESI,ESI：电喷雾电离源特点：应用范围广泛；离子化效率高，对蛋白质而言接近100%；多种离子化模式供选择：ESI（+）、ESI（-）；可产生多电荷离子，适于测量大分子量的蛋白质；属于“软”离子化模式，可分析热不稳定化合物。,37,大气压化学电离APCI,APCI：大气压化学电离源特点：属于“软”电离方式，适于分析质量数小于2000u的弱极性小分子化合物；多种离子化模式供选择：APCI（+）、APCI（-）；只产生单电荷离子，主要是准分子离子，很少有碎片离子。,38,实验室现有的液相色谱-质谱联用仪类型：液相色谱-质谱联用仪（1100LC-MSDTrapXCT，Agilent，科学楼7楼）三重四极杆质谱联用仪（TSQQuantumAccessMAX，ThermoFisher，科学楼8楼）微流控芯片液相质谱串联仪（1260LC,1200NanoHPLC-Chipcube-QTOF6520，Agilent，科学楼8楼）,液相色谱-质谱联用仪,39,在线真空脱气机,二元或四元梯度液相泵,自动进样器,柱温箱,二极管阵列检测器,液相色谱-质谱联用仪（1100LC-MSDTrapXCT）,离子阱质谱仪,40,ESI电离源,APCI电离源,离子源：ESI和APCI,41,什么是MSn?该方式是表明多级离子分离和碎裂步骤可产生离子质谱图。n=分离和碎裂步骤数目，最小是1（最后一步是全扫描).e.g.MS3意义1)一个母离子的分离和碎裂2)由前级碎裂得到的子离子的分离和碎裂3)全扫描质谱分析,质量分析器：离子阱（iontrap）,42,累积第一级离子分离第一级离子碎裂第二级离子分离第二级离子碎裂第三级质谱分析Mass,A+,A1+A2+A3+A4+,A2+,A11+A21+A31+A41+,A11+A21+A31+A41+,MS1MS2MS3,MS3的图解,43,易懂、易用、图型化的控制及分析软件,44,1.天然产物鉴定；2.生物制药及药物代谢分析；3.食品成分分析；4.蛋白质及多肽分析；5.农药及兽药残留分析。,应用范围,45,样品要力求干净，不含显著量的杂质，尤其是与分析无关的蛋白质和肽类；2.不含有高浓度的难挥发酸（硫酸、磷酸等）及其盐；3.样品粘度不能过大，防止堵塞柱子、喷口及毛细管入口。,送样要求,46,检测器,自动进样器,柱温箱,四元梯度液相泵,三重四极杆质谱仪,三重四极杆质谱联用仪（TSQQuantumAccessMAX）,47,离子源：HESI-II和APCI,加热电喷雾离子源（HESI-II）是采用电喷雾电离与加热辅助气相结合的方法，将溶液中的离子转换成气相中的离子。可分析所有在溶液中能预形成离子的极性化合物。,HESI-II电离源探针,离子源室,APCI电离源探针,48,进样方式,直接进样：（使用注射泵）LC液流不经过色谱分离：自动定量环进样至LC液流（使用注射泵）；手动定量环进样至LC液流；进样至LC液流（使用注射泵）；自动进样器进样至LC液流LC流路经过色谱分离：自动进样器经LC液流进样到色谱柱,49,Q1和Q3,Q2,质量分析器：三重四极杆（TSQ）,质量分析仪、离子探测系统和离子光学组件,TSQ上的质量分析仪包含三个四级杆组件（Q1、Q2和Q3）以及三个透镜组。,50,扫描模式,一、子离子扫描,51,扫描模式,二、母离子扫描,52,扫描模式,三、中性丢失扫描,53,扫描类型,一、全扫描在指定的扫描时间内，质量分析仪不间断地从第一个质量数扫到最后一个质量数，提供分析物的完整质谱，用于确认未知化合物。二、选择的离子监控（SIM）可监控某个离子或一组离子，适用于已知目标化合物分析，探测复杂混合物中的微量目标化合物时很有用。三、选择反应监控（SRM）可监控某个反应或几组反应，如离子的裂解或中性基团丢失。四、自动SIM质谱仪会在预扫描中自动选择最强烈的m/z值，为它们建立一个SIM扫描列表，然后采集和记录这些选定质量的离子。可在任何模式中的全扫描上执行。,54,控制及分析软件Xcalibur,55,控制及分析软件LCquan,56,应用范围,可同时对复杂基质样品进行多残留和定量实验，提供无与伦比的低浓度定量表现，并佐以快速，高特异性的全二级谱图扫描进行确认。该仪器主要应用于制药、环保、食品安全、临床和法医学等多种领域。,57,送样要求,样品必须是澄清溶液，不能有显著的杂质，需过滤(0.45m滤膜)；2.样品不能含有难挥发酸，强酸、强碱，盐，表面活性剂及ContaminationPeak表上的物质；3.所用溶剂一般为水、乙腈和甲醇，且溶剂需过滤(0.45m滤膜)。4.优化时标准品浓度一般为1-5ppm；测样时样品浓度一般为10-3ppm，不要超过0.1ppm。,58,微流控芯片液相质谱串联仪（1260LC,1200NanoHPLC-Chipcube-QTOF）,59,进样方式,直接进样1260LC进样1200N