第三章--细胞生物学研究方法 1

第三章细胞生物学研究方法,显微镜之于生物学，犹如望远镜之于天文学，细胞生物学的变革无不和显微技术的改进息息相关。1590年J.和Z.Janssen父子制作第一台复式显微镜，放大倍数不超过10倍。1932年德国学者MaxKnolls和ErnstRuska发明了第一台电子显微镜,研究技术、研究工具促进细胞生物学科的发展,显微镜的出现细胞学说的建立电子显微镜技术进入超微与分子形态水平超离心技术细胞成分、代谢过程的同位素示踪技术精确定性、定量分析单克隆抗体、分子杂交生物工程,第一节细胞形态结构的观察方法,一、光学显微镜技术二、电子显微镜技术三、扫描隧道显微镜,一、光学显微镜技术,1、普通复式光学显微镜技术2、相差显微镜技术3、荧光显微镜技术4、激光共焦点扫描显微镜技术,人眼100um,1cm,1mm,100um,10um,1um,100nm,10nm,1nm,0.1nm,光学显微镜,电子显微镜,扫描隧道显微镜,细菌,病毒核糖体,球蛋白,原子,植物、动物细胞,可见范围,1、普通复式光学显微镜技术,1）光学显微镜的组成,光学放大系统,照明系统,机械和支持系统,目镜,物镜,光源,折光镜,聚光镜,（滤光片）,2）分辨率,指区分开两个质点间的最小距离。,D=,0.61,N.Sin/2,：光源波长：物镜镜口角（最大值可达140度）N：介质折射率（空气中为1）,N.Sin/2也称数值孔径(镜口率),分辨率与光源的波长、物镜镜口角和介质折射率有关。,几种介质的折射率,成像原理样品被放置在光的通路中，样品会对光波产生干扰，这种干扰现象通过透镜被肉眼观察到。,为什么分辨率与光波波长有关？,照明系统的波长是显微成像的一个重要因素，波长决定能被检测样品的最小极限。,最大分辨率,以可见光作光源，其最大的分辨率为：,最好的玻璃透镜的镜口角是140，sin/2的最大值为0.94,空气的折射率为1,最短的可见光（蓝色光）的波长为450nm,D292nm,用油作为光折射的介质:D=0.2m(光学显微镜最大分辨率)用紫外光作光源可使D提高到约0.1m。,分辨极限与有效放大率,对可见光来说，能清楚地分辨出相邻两点之间的最小间隔是0.2m，这是分辨极限。,有效放大率：光学显微镜的分辨率约为0.2m，人眼的分辨率为0.2mm，因此显微镜的最大有效倍数为1000X。,取材固定包埋切片染色脱水透明封片观察,3）光学显微镜样品制备,固定：杀死细胞，稳定细胞的化学成分固定剂：甲醛、戊二醛,包埋：为了便于切片，防止样品移位。石蜡或树脂,染色：给细胞的不同组分带上可区别的颜色特征,切片：110m,光线通过细胞后的变化,2、相差显微镜,发明：19341935荷兰物理学家Zernike设计和发明相差显微镜，并获得诺贝尔奖。,优点：样品不需染色，可以观察活细胞。,原理：把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，表现为明与暗的对比，从而提高了各种结构之间的对比度，使标本的各种结构变得更清晰。,相差：在某一时间上，光的波动所能达到的位置，便是它的相位；两组波的相位不同，即相差。,x,y,透明玻璃,产生相位差,产生振幅差,Z,有明暗之分,吸光物质,相差显微镜的结构,聚光器或光源上增加一环形光阑，使透过聚光器的光线形成空心光锥，焦聚到标本上；物镜后装有一块“相差板”，相差板上涂有特殊吸光物质；偏斜和未偏斜的两组光线之间增添了新的光程差，从而对样品密度的不同造成的相位差起“夸大”作用；,吸光区,半透明圆环,不透明的涂漆部分,透明的环状部分,用途：观察未经染色的玻片标本。,3.荧光显微镜Fluorescencemicroscope,特点：光源为短波光；有两个特殊的滤光片：第一：激发滤片第二：阻断滤片,荧光显微镜,Fluorescenceimage,DNAinblueandMicrotubulesingreen,用于观察能激发出荧光的结构。用途：免疫荧光观察、基因定位、疾病诊断。,荧光显微镜及其照片,荧光显微镜技术,1）分为：,免疫荧光技术,荧光素直接标记技术,2）原理：（以免疫荧光技术为例）,特定抗原（细胞）,抗体,抗体抗原复合物,进行定位测定,荧光素,激发光,不同的荧光素的激发光波长范围不同，所以同一样品可以同时用两种以上的荧光素,（如：紫外线）,3）局限性：固定剂常会破坏抗原性；包埋剂常会产生自发荧光。,4、激光共焦点扫描显微镜技术,原理：是由一个激光扫描显微镜在物镜的成像面上加一个针孔组成，只有被照亮点发出的光才能通过共焦孔，偏离这一点的无用的荧光就被排除在最终的图像之外；物镜和聚光镜同时聚焦到同一个小点，即它们互相共焦点，极大的增加了对比度；逐点、逐行、逐面快速扫描，形成立体图像，能显示细胞样品的立体结构；,效果：使观察到的图像反差和分辨率提高分辨率比普通荧光学显微镜提高1.41.7倍。,激光共焦点扫描显微镜的原理图,共聚焦显微镜及其显微图像,免疫荧光显微镜技术（A）和激光扫描共焦显微镜技术(B)的比较,其他常用光学显微镜,倒置显微镜其结构组成与普通显微镜一样，所不同的是它的物镜与照明系统的位置颠倒过来，物镜在载物台的下方，可直接对培养的细胞进行照明和观察。,暗视野显微镜darkfieldmicroscope,聚光镜中央有挡光片，视野背景是黑的，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，物体边缘是亮的。可观察4200nm的微粒子，分辨率比普通显微镜高50倍。,当代显微镜的发展趋势,采用组合方式，集普通光镜、相差、荧光、暗视野、摄影装置于一体；自动化与电子化。,二、电子显微镜技术,（一）电子显微镜的基本知识1、基本构造,电子束照明系统：,电子枪,聚光镜,成像系统,物镜,中间镜,投影镜,真空系统,记录系统,（电磁透镜）,不同光线的波长,电子显微镜的分辨率为0.2nm，放大倍数可达百万倍；,2.电子显微镜与光学显微镜的基本区别,（二）主要电镜制样技术1、超薄切片技术,切片厚度一般仅为4050nm,固定：锇酸（OsO4）和戊二醛等；包埋：环氧树脂；切片：染色：重金属盐；形成明暗反差,电镜生物样品制备过程,固定,清洗后系列梯度丙酮或酒精脱水,浸泡于稀包埋剂中,包埋剂,样品杆,用玻璃刀或钻石刀切片,切片机,修块,包埋块,置温箱中包埋剂聚合,收集切片于载网上,重金属染色置电镜下观察,2、负染技术,用重金属盐(如磷钨酸)染色；吸去染料干燥后，样品凹陷处铺了一层重金属盐，而凸出的地方没有染料沉积，从而出现负染效果，分辨力可达1.5nm左右。,NegativeStainedArchaebacteria,3、冷冻蚀刻电镜技术,基本操作过程：,将标本在标本台上于196的液氮中超低温迅速冰冻；防止形成冰晶。用冷刀将冻结的标本骤然断开；当温度上升后，冰在真空条件下迅速升华，断裂面上的结构得以暴露（蚀刻）；再喷涂上一层蒸气铂和碳；将样品本身溶解掉，把喷涂上的碳和铂的膜剥离下来（复膜）；电镜观察。,冷冻蚀刻技术主要用来观察膜断裂面的蛋白质颗粒和膜表面结构。样品不需包埋、固定。能更好地保持样品的真实结构。,培养细胞内面的深度蚀刻电镜照片，示Clathrin衣被,3、扫描电镜技术,工作原理：是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出二次电子，二次电子的多少与样品表面形貌有关，二次电子由探测器收集，信号经放大用来调制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。CO2临界点干燥法防止引起样品变形的表面张力问题为了使标本表面发射出二次电子信号，标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属膜。,Redbloodcell,Yeast,人类精子,三、扫描隧道显微镜,原理：利用量子力学中的隧道效应（通常在低压下，二电极之间有很大的阻抗，阻止电流通过，称为叠势）当二电极之间近到一定距离（100nm以内）时，电极之间产生了电流，称为隧道电流，并且隧道电流和针尖与样品之间的间距呈指数关系。将扫描过程中电流的变化转换为图像，即可显示出原子水平的凹凸形态。,特点：1.原子尺度的高分辨率；2.可在真空、大气、液体等多种条件下工作；3.非破坏测量；,扫描隧道显微镜观察的DNA双螺旋结构,STMimageofaDNAmolecule,第二节细胞组分的分析方法,一、离心技术二、细胞内核酸、蛋白质、酶、糖类与脂质等的显示方法三、放射自显影技术四、分子杂交技术五、定量细胞化学分析技术,一、离心技术,差速离心密度梯度离心,是分离细胞器及各种大分子基本手段。转速1025kr/min的离心机称为高速离心机。转速30kr/min，离心力89Kg者称为超速离心机。超速离心机的最高转速可达150000r/min，离心力超过500kg。,方法：,（一）差速离心利用不同的离心速度所产生的不同的离心力，将各种亚细胞组分和各种颗粒分开。,原理:在一定的离心速度下，不同大小的细胞器由于体积的不同，沉降的速度也不同，体积大的沉降的快，反之沉降的慢。,用途：分离大小相差悬殊的细胞和细胞器。,结构离心力细胞核8001000g线粒体20,000-30,000g叶绿体20,000-30,000g溶酶体20,000-30,000g微体20,000-30,000g粗面内质网50,000-80,000g质膜和光面内质网80,000-100,000g游离核糖体、病毒粒子150,000-300,000g,不同的细胞结构分离所需的离心力,沉降顺序：核线粒体溶酶体与过氧化物酶体内质网与高基体核蛋白体。,（二）密度梯度离心,用介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将分离的细胞组分小心置于介质的顶部，通过离心力场的作用使样品中不同组分以不同的沉降率沉降，形成不同的沉降带，从而将细胞成分分层、分离。类型：速度沉降、等密度沉降。常用介质：氯化铯、蔗糖、多聚蔗糖。,1.速度沉降velocitysedimentation,用途：分离密度相近而大小不等的细胞组分。特点：介质密度较低。原理：介质密度梯度平缓，分离物按各自的沉降系数以不同的速度沉降而达到分离。,2.等密度沉降isopycnicsedimentation,用途：分离密度不等的颗粒。特点：1）介质密度高，陡度大，介质最高密度大于被分离组分的最大密度。2）力场比速度沉降法大10100倍，需要高速或超速离心。原理：样品各成分在连续梯度的介质中经过一定时间的离心则沉降到与自身密度相等的介质处，并停留在那里达到平衡，从而将不同密度的成分分离。,密度梯度离心法与差速离心法,二、细胞内核酸、蛋白质、酶、糖类与脂质等的显示方法,为了测定蛋白质、核酸、多糖和脂类等细胞组分，常利用一些显色剂与所检测物质中特殊基团的特异性结合，通过显色剂在细胞中出现的部位和颜色显示的程度，从而判断被检物质在细胞中的分布和含量。,DNAFeulgen反应,多糖PAS反应如淀粉、纤维素及动物细胞中的糖原、粘蛋白等。,脂类苏丹染色等,蛋白质Millon反应,三、放射自显影技术,用于研究标记化合物在机体、组织和细胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用机理、作用部位等等。原理：将放射性同位素标记的化合物导入生物体内，经过一段时间后，制取切片，涂上卤化银乳胶，经放射性曝光，使乳胶感光。一般用14C和3H标记。常用3H-TDR来显示DNA，用3H-UDR显示RNA；用3H氨基酸研究蛋白质，用3H甘露糖、3H岩藻糖研究多糖。14C半衰期为5730年，3H为12.5年。,四、分子杂交技术,具有互补核苷酸序列的两条单链核苷酸分子片段，在适当条件下，通过氢键结合，形成DNA-DNA，DNA-RNA或RNA-RNA杂交的双链分子。这种技术可用来测定单链分子核苷酸序列间是否具有互补关系。原位杂交（insituhybridization）。用于检测染色体上的特殊DNA序列。最初是使用放射性DNA探针，后来又发明了免疫探针法。,人类染色体端粒DNA的荧光原位杂交照片,五定量细胞化学分析技术,（一）显微分光光度测定技术利用细胞内某些物质对特异光谱的吸收，测定这些物质，如核酸与蛋白质等）在细胞内的含量。包括：紫外光显微分光光度测定法可见光显微分光光度测定法,（二）流式细胞仪（FlowCytometry）,主要应用：用于定量测定细胞中的DNA、RNA或某一特异蛋白的含量；测定细胞群体中不同时相细胞的数量；从细胞群体中分离某些特异染色的细胞；分离DNA含量不同的中期染色体。,流式分选仪,2000V,2000V,高压偏转板,充以正电的小水滴,充以负电的小水滴,分别收集细胞,激光,排列成单列的细胞通过激光束时，仪器可测定出标记细胞上的荧光强度；仪器使带有荧光细胞的小水滴充电；带电水滴通过高压偏转板偏离原来方向，收集细胞；未含标记的细胞或不含有细胞的水滴不偏转。,水滴充电信号,第三节细胞培养、细胞工程技术与显微操作技术,一、细胞培养,细胞培养技术是细胞生物学研究方法中最有价值的技术，通过细胞培养可以获得大量的细胞，也可通过细胞培养研究细胞的运动、细胞的信号传导、细胞的合成代谢等。,体外培养细胞必须注意三个环节：,物质营养：由培养基提供。,物质营养、生存环境和废物的排除。,1、原代培养,原代培养是指直接从机体取下细胞、组织和器官后立即进行培养。但一般通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。,（一）动物细胞培养,2、细胞系和细胞株,原代培养经首次传代成功后即为细胞系,细胞系传至50代后，许多细胞不能再传下去，但有少部分细胞发生遗传突变，可在培养条件下无限制地传下去，这种传代细胞称为永生细胞系。,10代原代培养,50代传代培养遗传物质不变，接触抑制（细胞系）,传代培养遗传物质发生变化，无接触抑制,3、动物细胞培养方法,贴壁培养,分散的细胞悬浮在培养瓶中很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁，贴壁后的细胞形态形成多态性，呈单层生长，所以此法又叫单层细胞培养，单层培养的细胞保持接触抑制的特性。,悬浮培养,悬浮培养的细胞在培养过程中不贴壁，一直悬浮在培养液中生长，如T细胞的培养就是如此。悬浮培养的条件较为复杂，难度也较大，但是容易同时获得大量的培养细胞。,（二）植物细胞培养,单倍体细胞培养：花药原生质体培养：体细胞经纤维素酶处理去掉细胞壁原生质体,(三)非细胞体系：由来源于细胞，而不具有完整的细胞结构与成分，但包含了进行正常生物学反应所需的物质（如供能系统和酶反应体系等）组成的体系。用于DNA复制，RNA转录，蛋白质合成，高尔基体的膜泡运输，细胞核装配等细胞提取物，细胞核提取物,二、细胞工程（一）细胞融合,细胞融合是指自发或人工诱导下，两个或多个细胞融合形成一个双核或多核细胞的现象。,自发的动物细胞融合几率很低，1962年Okada和Tadokoro发现灭活的仙台病毒有促进细胞融合的作用。病毒外壳上的糖蛋白具有促进细胞融合的功能。聚乙二醇也有促进细胞融合的功能。,（二）单克隆抗体,1975年英国科学家Milstein和Kohler将产生抗体的淋巴细胞同肿瘤细胞融合，成功建立了单克隆抗体技术，而获得1984年诺贝尔医学和生理学奖。每个B淋巴细胞仅专一地产生、分泌一种针对某种抗原决定簇的特异性抗体，而肿瘤细胞可以无限增殖，因此杂交瘤细胞可在体外培养或移植到体内条件下分泌大量单克隆抗体。单克隆抗体技术的最主要优点是可以用不纯的抗原分子大量制备纯一的单克隆抗体。,杂交瘤细胞产生单克隆抗体示意图,取出制造该抗原特异的抗体的B淋巴细胞,骨髓瘤细胞,混合并进行细胞融合,注射抗原,未融合细胞死亡,杂合细胞生长,逐个细胞分开培养,检查每孔