第3章--细胞生物学研究方法

第3章细胞生物学研究方法,细胞形态结构的观察方法细胞组分的分析方法细胞培养、细胞工程与显微操作技术用于细胞生物学研究的模式生物,第一节细胞形态结构的观察方法,光学显微镜技术（lightmicroscopy）电子显微镜技术(Electromicroscopy)扫描遂道显微镜(Scanningtunnelingmicroscope),一、光学显微镜技术（lightmicroscopy),普通复式光学显微镜技术相差显微镜（phase-contrastmicroscope）微分干涉显微镜（differential-interferencemicroscope）荧光显微镜技术（FluorescenceMicroscopy）激光共焦扫描显微镜技术（LaserConfocalMicroscopy）荧光共振能量转移技术荧光漂白恢复技术,1、普通光学显微镜技术,显微镜结构：机械部分：镜座、镜柱、镜臂镜筒、调焦装置、载物台（物镜转换器）照明部分：反光镜、聚光镜光学部分：目镜、物镜,放大倍数(magnification):最终成像的大小与原物体大小的比值。总放大倍数=物镜放大倍数目镜放大倍数光学显微镜的最大放大倍数为1,000倍.电子显微镜的最大放大倍数为1,000,000.,普通复式光学显微镜技术,分辨率（即分辨极限,D）是指区分开两个质点间的最小距离。,习惯说的分辨率高则是指该分辨极限小；人眼的分辨率：100m，光学显微镜的最大分别率：0.2m。,放大倍数:光学显微镜在用空气作介质时，最大放大倍数为1000倍，用油镜时为1400倍。,分辨率（Limitofresolution）对可见光来说，能清楚分辨出相邻两点之间的最小间隔为0.2m。0.610.5m/1.510.2m,P50,数值孔径,几种介质的折射率,不同光线的波长,下列()与显微镜能达到的分辨率无关。,A光波波长B物镜的放大倍数C标本和透镜之间的物质的折射率D透镜的数值孔径,固定（甲醛等）包埋（石蜡、树脂等）切片（切片机）染色观察,石蜡切片,石蜡切片,相差显微镜,原理：利用光的衍射和干涉特性使相位差变成振幅差，表现为明与暗的对比。两个特殊构件：环状光阑（annulardiaphragm）：位于光源与聚光器之间。相位板（annularphaseplate）：涂有光吸收物质和相位推迟物质。,用途：能观察无色、透明、活细胞中的结构。,微分干涉显微镜,HumanCheekEpithelialCells,微分干涉显微镜原理：利用两组平面偏振光的干涉，加强影像的明暗效果，能显示结构的三维立体投影。,应用：适于研究活细胞中较大的细胞器、颗粒及其运动。计算机辅助的DIC分辨率比普通光镜提高了一个数量级。应用这一原理制备的录像增差显微镜（video-enhancemicroscopy）可以观察微管上颗粒的运动。,C.elegans(线虫)expressingGFP,visualizedunderdifferentialinterferencecontrastmicroscopy(top)andfluorescencemicroscopy(bottom).,荧光显微镜技术（FluorescenceMicroscopy）,Ethidium,PE,cis-Parinaricacid,TexasRed,PE-TRConj.,PI,FITC,波长,荧光染料,荧光显微镜技术,免疫荧光技术（见本章第2节）荧光素直接标记技术,荧光素直接标记技术,TheadherentcultureofBPAEcellsfeaturedinthissectionwaslabeledwithMitoTrackerRedCMXRos(mitochondria;yellow),AlexaFluor488(filamentousactin;green),AlexaFluor647(nuclearporecomplexprotein;red),andHoechst33342(nucleus;cyan).,2008年诺贝尔化学奖,日本科学家下村修、美国科学家马丁沙尔菲和美籍华裔科学家钱永健获得2008年的诺贝尔化学奖。这三位科学家因在发现和研究绿色荧光蛋白（greenfluorescentprotein，GFP）方面做出贡献而获奖。,2008年美国科学家培育出世界首只能“发光”的猫,随着病毒在宿主体内不断扩散，就可以通过跟踪发出的绿光来观察病毒的扩散途径,使用绿色荧光蛋白跟踪大脑细胞的活动,大脑彩虹图获得了2007奥林巴斯生物数字成像大奖,绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein),定义：绿色萤光蛋白(greenfluorescentprotein)，简称GFP，这种蛋白质最早是在水母中发现，其基因所产生的蛋白质会发出绿色荧光。在生物学领域中，绿色萤光蛋白基因常被用作为一个报告基因(reportergene)。,激光扫描共聚焦显微镜技术（ConfocalLaserScanningMicroscope）,采用激光束做光源，激光束经照明针孔，经由分光镜反射至物镜，并聚焦于样品上，对标本内焦平面上的每一点进行扫描，然后激发出的荧光经原来入射光路直接反向回到分光镜，通过探测针孔时产生聚焦，聚焦后的光被光电倍增管探测收集，并将信号输送到计算机，在彩色显示器上显示图像。,laserconfocalscanningmicroscope,LCSM,优点1：图像清晰,优点2：多重荧光标记,Golgiapparatus(inred)andthemitoticspindles(ingreen)ofanearlyDrosophila（果蝇）embryoundergoingmitosis.,cytoskeletonmicrotubules(green),actinfilaments(red),andthenucleus(blue).,优点3：观察三维空间结构,在显微镜载物台上加一个微量步进马达，使载物台上下移动，改变焦平面，不同层次的光切面图像经计算机图像三维重组，就可以无损伤地分析细胞的三维空间结构。,优点3：观察三维空间结构,优点4：活细胞的动态观察,优点4：活细胞的动态观察,荧光共振能量转移P54fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET,当一个供体荧光分子的荧光光谱与另一个受体荧光分子的激发光谱相重叠时，供体荧光分子的激发能诱发受体分子发出荧光,同时供体荧光分子自身的荧光强度衰减。FRET程度与供、受体分子的空间距离紧密相关，一般小于10nm时即可发生FRET,GFP的两个突变体,CFP（cyanfluorescentprotein）YFP（yellowfluorescentprotein）,荧光共振能量转移,ThedistancebetweenactinmonomersinF-actinis55,whichiswithinthetypicalrangeforFRET(10100).TaggingactinwithCFPandYFPasdonorandacceptor,respectively,allowsustouseFRETtoobservetheequilibriumbetweenF-actinandG-actininlivingcells.,荧光共振能量转移的应用,蛋白质结构、功能分析核酸检测细胞器结构功能检测等,荧光漂白恢复技术P55fluorescencerecoveryafterphotobleaching,FRAP,借助高强度激光照射细胞某一区域，造成该区域荧光分子的光淬灭，周围的非淬灭荧光分子将以一定速率向受照区域扩散，可通过低强度激光扫描探测此扩散速率。,荧光漂白恢复技术在细胞生物学中的应用,分析细胞内蛋白质运输、受体在细胞膜上的流动和大分子组装等细胞生物学过程。,是检测活体中生物大分子纳米级距离和纳米级距离变化的有力工具，可用于检测某一细胞中两个蛋白质分子是否存在直接的相互作用。,A)荧光漂白恢复技术B)相差显微镜技术C)微分干涉显微镜技术D)荧光共振能量转移技术,二、电子显微镜（electronmicroscope）,1932年德国学者MaxKnolls和ErnstRuska用波长比光短得多的电子作光源,发明了第一台电子显微镜，大大提高了显微镜的分辨率（0.2nm），放大倍数可达百万倍，用于观察超微结构。,电子束照明系统：主要由灯丝阴极和阳极组成。阴极电压通常50120KV，阳极为0V，两极的电压差异称为加速电压。电子束的波长与加速电压的平方根成反比。成像系统：改变电子方向。真空系统：保持电镜真空，防止空气中分子会阻挠电子束的发射而不能成像。记录系统：,工作原理：电子束扫描样品，在样品表面激发出二级电子，由探测器收集，信号经放大后在荧光屏上显示出与电子束同步的扫描图像。,1透射电镜（TransmissionelectronMicroscopeTEM）电子穿过样本，观察超薄切片2扫描电镜（ScanningelectronMicroscopeSEM）用于观察固体表面的形貌,电子显微镜分类,1透射电镜,超薄切片样品制备,超薄切片技术电镜负染色技术冷冻蚀刻电镜技术电镜三维重构技术,电镜技术,超薄切片(uitrathinsection)电子束穿透力很弱，用于电镜观察的标本须制成厚度仅50nm的超薄切片，用超薄切片机（ultramicrotome）制作。通常以锇酸和戊二醛固定样品，丙酮逐级脱水，环氧树脂包埋，以热膨胀或螺旋推进的方式切片，重金属（铀、铅）盐染色。,负染色(negativeStaining)和投影(shadowcasting)技术,负染色:用重金属盐(如磷钨酸钠)对铺展在载网上的样品染色,使整个载网都铺上一层重金属盐,而凸出的样品则没有染料.投影技术:又叫喷镀技术,是一种重要的增强背景和待观察样品反差的方法.,冰冻蚀刻(freeze-etching)冰冻断裂与蚀刻复型：主要用来观察膜断裂面的蛋白质颗粒和膜表面结构。,快速冷冻深度蚀刻技术(AYeastCell),电镜三维重构技术,扫描电镜,扫描电镜是用极细的电子束在样品表面扫描，将产生的二次电子用特制的探测器收集，形成电信号运送到显像管，在荧光屏上显示细胞、组织表面的立体构像。,扫描电镜,扫描电镜照片展示,注射针头的扫描电镜照片,扫描电镜照片展示,不同倍率的果蝇扫描电镜照片,扫描电镜照片展示,可以用计算机将黑白照片处理成彩色,扫描电镜照片展示,扫描电镜照片展示,肺细支气管粘膜杯状细胞和纤毛细胞扫描电镜照片,扫描电镜照片展示,扫描电镜照片展示,培养细胞,扫描电镜照片展示,扫描电镜,透射电镜,三扫描隧道显微镜,原理：根据量子力学中的隧道效应原理制成，可用于研究表面的原子结构和电子结构。特点：可对晶体或非晶体成像，分辨本领高；可实时得到样品表面三维图象；可在真空、大气、液体等多种条件下工作；非破坏性测量；可连续成像，进行动态观察。用途：纳米生物学研究领域中的重要工具,在原子水平上揭示样本表面的结构。,利用扫描隧道显微镜直接获取细胞膜、细胞表面、病毒、生物大分子的结构信息,realimage,可以利用()直接获取细胞膜、细胞表面、病毒、生物大分子的结构信息。,A扫描隧道显微镜B扫描电镜C透射电镜D激光扫描共聚焦显微镜,第二节细胞组分的分析方法,超高速离心分离技术细胞内核酸、蛋白质、酶、糖与脂类等的显示方法特异蛋白抗原的定位与定性细胞内特异核酸的定位与定性放射自显影技术定量细胞化学分析技术,一、超高速离心分离技术,用途：分离细胞器与生物大分子及其复合物差速离心：分离密度不同的细胞组分密度梯度离心：精细组分或生物大分子的分离,差速离心Differentialcentrifugation,特点：介质密度均一；速度由低向高，逐级离心。用途：分离大小相差悬殊的细胞和细胞器。沉降顺序：核线粒体溶酶体与过氧化物酶体内质网与高基体核蛋白体。可将细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯离心再行分离纯化。,密度梯度离心（densitygradientcentrifugation）,密度梯度离心是将要分离的组分放在已形成密度梯度的惰性物质（如蔗糖）溶液的表面，在这种条件下进行离心，不同组分以不同的沉降速度沉降，形成不同的沉降带。,不同的细胞器、大分子和病毒的密度及相应的沉降系数,2.2密度梯度离心,二、细胞内核酸、蛋白质、酶、糖与脂类等的显示方法,原理：利用一些显色剂与所检测物质中一些特殊基团特异性结合的特征，通过显色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来判断某种物质在细胞中的分布和含量。,FeulgenStainingmethodisspeicificforDNA(onionroottipcell),糖类显示：PAS反应,最常用于显示细胞、组织内的多糖和蛋白多糖的方法是过碘酸-雪夫反应（periodicacidSchiff，PAS反应)。基本原理是：糖被强氧化剂过碘酸（HIO4)氧化后，形成2-醛基；后者与Schiff试剂中的无色品红亚硫酸复合物结合，形成紫红色反应产物，PAS反应阳性部位即表示多糖的存在。,脂类显示,标本可用甲醛固定、冷冻切片、用油红、苏丹、苏内、苏丹黑B、尼罗蓝等脂溶性染料染色,AKP(碱性磷酸酶)染色,Feulgen反应是一种经典的细胞化学染色方法，常用于细胞内（）。,A蛋白质的分布与定位B脂肪的分布与定位CDNA的分布与定位DRNA的分布与定位,三、特异蛋白抗原的定位与定性,免疫荧光技术：快速、灵敏、有特异性，但其分辨率有限免疫电镜技术：免疫铁蛋白技术免疫酶标技术免疫胶体金技术,免疫荧光技术:表面抗原与受体,Adhesion,Receptors,Metabolic,cytokines,structure,enzymes,抗原,标记抗体,光原,荧光,直接免疫荧光法,间接法原理示意图,抗原,抗体1,标记抗体2,光原,荧光,间接免疫荧光法,免疫胶体金技术原理,免疫胶体金技术是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术。胶体金是由氯金酸在还原剂作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，称为胶体金。,胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。,胶体金,胶体金应用,胶体金应用,胶体金标记技术由于标记物的制备简便，方法敏感、特异，不需要使用放射性同位素，或有潜在致癌物质的酶显色底物，也不要荧光显微镜，它的应用范围广，除应用于光镜或电镜的免疫组化外，更广泛地应用于各种液相免疫测定和固相免疫分析以及流式细胞术等。,四、细胞内特异核酸的定位与定性,光镜水平的原位杂交技术（同位素标记或荧光素标记的探针）电镜水平的原位杂交技术（生物素标记的探针与抗生物素抗体相连的胶体金标记结合）,核酸分子杂交,按照碱基互补配对原则，将不同来源的序列互补单链的DNA/DNA，RNA/RNA，RNA/DNA，互补配对成双链杂交分子，这一过程叫核酸分子杂交,常用核酸分子杂交技术,Southern印迹杂交；Northern印迹杂交；斑点杂交(dotblotting)；原位杂交(insituhybridization),Blotting：印迹杂交,SouthernBlotting:检测特定DNA片断NorthernBlotting:检测RNAWesternBlotting:检测蛋白质,斑点杂交,将PCR产物点在硝酸纤维素膜或尼膜薄膜上，再用内部寡核苷酸探针杂交，观察有无着色斑点，主要用于PCR产物特异性鉴定及变异分析。,原位杂交（insituhybridization),应带有标记的（有放射性同位素、荧光素、生物素、地高辛等非放射性物质)DNA或RNA片段作为核酸探针,与组织切片或细胞内待测核酸片段进行杂交，然后可用放射自显影等方法予以显示，在光镜或电镜下观察目的mRNA或DNA的存在与定位；也可在原位研究细胞合成某种多肽或蛋白质的基因表达。,荧光原位杂交（fluorescenceinsituhybridization,FISH）,人类染色体端粒DNA的荧光原位杂交照片,合成,TheisatechniqueusedinmolecularbiologyresearchtostudygeneexpressionbydetectionofRNAinasample.,AsouthernblottingBwesternBlottingCnorthernBlottingDfluorescenceinsituhybridization,五、放射自显影技术,原理及应用：利用同位素的放射自显影，对细胞内生物大分子进行定性、定位与半定量研究；实现对细胞内生物大分子进行动态和追踪研究。步骤：标记前体物掺入细胞放射自显影追踪,标记物,一般常用3H胸腺嘧啶脱氧核苷（3H-TdR）来显示DNA用3H尿嘧啶核苷（3H-UdR）显示RNA；用35S标记的甲硫氨酸、半胱氨酸，3H或14C标记的甲硫氨酸、亮氨酸研究蛋白质用3H甘露糖、岩藻糖等研究多糖。,分离细胞器与生物大分子及其复合物的主要技术是（）,A、超高速离心分离技术B、insituhybridizationC、层析技术D、WesternBlotting,六定量细胞化学分析技术,细胞显微分光光度术（microspectrophotometry）利用细胞内某些物质对特异光谱的吸收，测定这些物质（如核酸与蛋白质等）在细胞内的含量。包括：1）紫外光显微分光光度测定法2）可见光显微分光光度测定法流式细胞术（FlowCytometry）,流式细胞术的基本原理Flowcytometry,流式细胞术的基本原理Flowcytometry,InjectorTip,Fluorescence,signals,Focusedlaser,beam,Sheathfluid,流式细胞仪的基本结构Flowcytometer,Lasers,Fluidics,Computers,Detectors,LaserPowerSupply,BDVantageSEDiVaoption,BeckmanCoulterEpicsAltraHypersort,DakoCytomationMoFlo,BDFACSAria,流式细胞术的基本原理Flowcytometry,LaserLight488nm,FL2PE,SSC,FSC,Fluidics,Electronics,Computer,FL3PerCP,Cy5,FL1FITC,Flowcytometer,Lightdetectors,PMT,PMT,PMT,PMT,Dichroic,Filters,Bandpass,Filters,FlowCytometry,Laser,1,2,3,4,Flowcell,滤光片,488nmlaser,-,特点,1.测量速度快；2.可进行多参数测量；3.既能分析，又能分选。,流式细胞术的应用,免疫学血液学肿瘤学细胞生物学细胞遗传学生物化学-,检测1：细胞大小、颗粒度,分散成单个细胞，DNA荧光染料充分标记后检测,检测1：DNA含量,DNAstainedwithpropidiumiodide,DNAContent,IncreaseinFluorescenceIntensity,#ofEvents,实体肿瘤DNA倍体(细胞周期)的分析,G2,M,G0,G1,s,0,200,400,600,800,1000,s,DNAAnalysis,DNAcontent,Count,CancercellswithabnormalDNAcontent,细胞凋亡检测,细胞标志（抗原）检测,人外周血淋巴细胞亚群检测,根据细胞标志（抗原）检测细胞凋亡,AnnexinVAssay检测细胞凋亡,1000,CalciumFlux,Time,Additionofstimulus,Additionofstimulus,Indo-1ratio,AddMIP1,Antibody+CalciumFlux:Whichcellsrespond?,Antibody+CalciumFlux:Whichcellsrespond?,GR-1FITC,7/4PE,荧光蛋白,细胞分选,细胞分选,举例1：X、Y-精子分选,X、Y-精子分选,性别控制,流式细胞术小结（flowcytometry，FCM),1）是一种可以对高速流动的细胞或亚细胞结构进行快速测量和分选的新型技术，是近代细胞生物学、分子生物学、分子免疫学和单克隆技术、激光技术、电子计算机术等学科高度发展的综合结晶。在免疫学、血液学、肿瘤学等学科及临床研究方面得到广泛应用。,2）特点：1.测量速度快；2.可进行多参数测量；3.既是细胞分析技术，又是精确的分选技术。3）用途：略,流式细胞术不可以用于（）,A、测定细胞的大小和特定细胞类群的数量B、分选出特定的细胞类群C、检测细胞中DNA、RNA或某种蛋白的含量D、观察分析细胞的三维空间结构,第三节细胞培养、细胞工程与显微操作技术,细胞的培养细胞工程,原代培养（primaryculturecell）传代培养（sub-culturecell）,动物细胞培养,动物细胞工程,染色体工程,四、用于细胞生物学研究模式生物,1)生理特征能够代表生物界的某一大类群2)容易获得并易于在实验室内饲养繁殖3)容易进行实验操作,特别是遗传学分析4)世代短，子代数目