细胞生物学]绪论

医学细胞生物学,MedicalCellBiology,2,2020/5/30,第一章绪论CHAPTER1INSTRUCTION,What?Why?How?,3,2020/5/30,第一章绪论,Chapter1Introduction,一、细胞生物学研究的对象和内容-what?二、细胞生物学与医学的关系-why?三、细胞生物学的分支学科四、细胞生物学的发展简史五、细胞生物学研究的技术和方法-how?,4,2020/5/30,一、细胞生物学研究的对象和内容,几个基本概念Whatiscell？Whatiscellbiology？Whatismedicalcellbiology？,What?,Whatiscell？,5,2020/5/30,Whatiscell？,细胞(cell)是微小的、由膜包围的单元，它充满着浓的化合物水溶液，可通过生长分裂制造自身的复制品，是生物体的形态结构和功能单位。,6,2020/5/30,Whatiscellbiology？,细胞生物学(cellbiology)：是从细胞整体、超微和分子水平上研究细胞的结构和生命活动规律的科学。,7,2020/5/30,Whatismedicalcellbiology,医学细胞生物学(medicalcellbiology)：是应用细胞生物学的理论和方法，研究人体细胞的形态结构与功能等生命活动规律，探索人类疾病发生、发展及其防治的科学。,8,2020/5/30,9,2020/5/30,一、细胞生物学研究的对象和内容,What?,10,2020/5/30,组织工程与再生医学干细胞技术及其在医学中的应用细胞工程与克隆技术生物制药,二、细胞生物学与医学的关系,1.细胞是生命的基本结构和功能单位；2.细胞生物学是基础医学和临床医学的基础学科；3.细胞生物学是基础医学和临床医学的前沿学科；4.细胞生物学技术在医学领域得到广泛应用。如组织工程、干细胞、克隆技术、生物制药和医用生物学产品等。,Why?,11,2020/5/30,1.组织工程与再生医学(TissueEngineeringandRegenerativeMedicine）:,目前缺损组织或器官的修复主要有三种方法：自体移植异体移植组织代用品,如硅橡胶、不锈钢和镍钛合金,12,2020/5/30,组织或器官体外生长的细胞来源：组织的活体碎片人的ES细胞,成功的范例：组织工程方法已成功地使膀胱组织工程皮肤、血管、人耳鼠等。,13,2020/5/30,组织工程制作膀胱的过程：,植入狗后证明可获得正常膀胱的95%的生理功能，排尿正常，在移植11个月后检查，膀胱完全由膀胱上皮和肌肉组织覆盖，并有神经和血管生成。,14,2020/5/30,金岩教授展示组织工程皮肤,只需小指甲盖大小的人类皮肤组织，便可培养出数亿倍的活性皮肤。作为目前我国组织工程研究的唯一成功产品，这种可由工厂生产、名为安体肤的人造皮肤含有活细胞，不仅具有真皮层和表皮层，在色泽、质感、生物相溶性上实现了以假乱真，而且可直接用于各类皮肤创伤患者。12月18日，负责该研究的年仅44岁的我国组织工程皮肤研究负责人金岩教授在第四军医大学进行了成果展示。这一经国家食品药品监督管理局正式批准注册、具有完全自主知识产权的我国首个组织工程产品的正式面世，在我国组织工程研究领域具有里程碑意义。,16,2020/5/30,具有抗凝血功能的组织工程化血管支架,苏州同科生物材料有限公司,17,2020/5/30,组织工程与“人耳鼠”,2001年，我国举办了“863计划十五周年成就展”，其中展出的“人耳鼠”受到了广泛地关注。“人耳鼠”的制作关键在“人耳”，先用一种高分子化学材料聚羟基乙酸做成人耳的模型支架，让细胞在这个支架上繁殖生长，然后，在裸鼠的背上割开一个口子，将已经培养好的“人耳”植入后缝合。“人耳”支架最后会自己降解消失，于是，“人耳”便与老鼠浑然成为一体。,18,2020/5/30,2.干细胞(stemcell),干细胞一种未充分分化，尚不成熟的细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能，医学界称为“万用细胞”。根据其发育阶段，干细胞可分为两种。来源于胚胎-胚胎干细胞ESC(EmbryonicStemCell);来源于成体-成体组织来源的干细胞ASC（Adult-derivedStemCell）,19,2020/5/30,脐带血干细胞移植,1988年十月发生在美国Colorado的一个故事,InearlyOctober,aColoradocouplehasababynamedAdam,whoseumbilicalcordstemcellscouldcurehissix-year-oldsisterMollysFanconianemia.,举例,20,2020/5/30,神经干细胞,NeuralStemCellsAbletoRepairDamageThroughoutBrainSciencesUSA96,7029-7034,June8,1999Instudieswithmice,neuralstemcellshavebeenshowntogloballyreplacedamagedbraintissue.Thestudy,performedbyresearchersatHarvardMedicalSchool,involvedtransplantingneuralstemcellsfrombornmiceintothebrainsof“shiverer”mice,amodelforParkinsonsandsimilarcentralnervoussystemdiseases.Theneuralstemcellswereabletomigratethroughoutthebraintorepairdamagedtissue.Treatedmiceshowedadecreaseintremors.,举例,iPS（inducedPluripotentStemCell）是由体细胞诱导而成的干细胞，具有和胚胎干细胞类似的发育多潜能性。,国际权威科学杂志自然(Nature)2009年7月23日在线发表中国科学院动物研究所研究员周琪领导的研究组和上海交通大学医学院教授曾凡一领导的研究组共同完成的一项研究成果，我国科学家首次利用iPS细胞(诱导性多能干细胞)，通过四倍体囊胚注射得到存活并具有繁殖能力的小鼠，从而在世界上第一次证明了iPS细胞的全能性。,21,2020/5/30,22,2020/5/30,干细胞治疗疾病的最显著特点：它可以治疗许多疾病，例如制造脑部神经元来治疗Alzheimer病与帕金森综合征，制造胰岛细胞来根绝糖尿病，制造心肌细胞来修补心脏等。iPS(inducedhumanpluripotentstem)细胞有望成为实施再生医学和细胞治疗的重要细胞来源。细胞治疗和组织工程技术已被视为未来人类疾病治疗的主流。,Startingawarthathaskilledthousandsofpeopleisok,butkillingafewcellsforthesakeofmedialresearchisbad.-GeorgeW.Bush,AbouthumanEScells,IsupportthehEScells,2009年3月9日签署关于废止干细胞研究禁令逆转了自2001年8月9日以来政府对胚胎干细胞研究限制的政策。奥巴马在仪式上说道：“总有一天，绝症和不治之症这样的字眼将有可能从我们的词汇里消失”时，全场长时间起立鼓掌。,红颜薄命多莉羊，未老先衰安乐死,姓名：Dolly,Dolly,性别：雌,生于1996年7月5日2003年2月14日逝世,子女：生育6名，存活5名,死亡方式：安乐死,维尔穆特和克隆羊“多莉”,基因母亲：一只6岁FinnDorset种白绵羊,线粒体母亲：一只苏格兰黑脸羊,提取细胞核,提取乳腺细胞,挨饿5天,egg,去核,融合,生育母亲：一只苏格兰黑脸羊,28,2020/5/30,3.生物制药,比尔盖茨预言：下一个首富可能是从事生物技术的投资者。生物制药是指运用新技术从生物体、生物组织、细胞、体液等提取“可用之物”，综合利用微生物学、化学、生物化学、生物技术、药学等科学的原理和方法，制造的一类用于预防、治疗和诊断的制品。利用基因工程技术生产细胞因子、激素及血液因子等，已作为商品广泛应用于临床。据估计，已经有40%药品基于生物技术。,29,2020/5/30,三、细胞生物学的分支学科,30,2020/5/30,四、细胞生物学的发展简史,大致划分为四个时期：细胞的发现和细胞学说的创立（16651875）经典细胞学发展阶段（18751900）实验细胞学发展阶段（l9001943）分子生物学发展阶段（1944）,31,2020/5/30,（一）细胞的发现和细胞学说的创立（16651875),1590年，荷兰眼镜制造商Janssen试制成功第一架复式显微镜（不超过10倍）。,32,2020/5/30,1665RobertHookenamedcell,Theword“cell”wasfirstusedbyRobertHookein1665whenheobservedthatcorkviewedunderthemicroscopewascomposedofnumeroussimilarstructure.,33,2020/5/30,Micrographia,34,2020/5/30,1674年，荷兰布商Leeuwenhoek观察到血细胞、池塘水滴中的原生动物（纤毛虫）、细菌和精子等活细胞。,35,2020/5/30,MadebyA.vanLeeuwenhoek(1632-1723).Magnificationrangesat50-275x.,36,2020/5/30,18381839年，Schleiden和Schwann分别论证植物和动物都是由细胞组成，首次提出细胞学说（celltheory）。证明了生物界的统一性。,37,2020/5/30,RudolfVirchow,完整的细胞学说包括4个要点：,所有生物都是由细胞组成的。所有细胞在结构和组成上基本相似。新细胞来源于已有细胞的分裂。生物的疾病是因为其细胞机能失常。（1858年，Virchow）,38,2020/5/30,(二)细胞学的经典时期(18751900年),提出原生质理论1861Schultze-原生质（protoplasm）理论发现了细胞分裂的主要类型1841Remak-鸡胚血细胞直接分裂1880Flemming-有丝分裂1886Strasburger-减数分裂发现了重要的细胞器1883Boveri-中心体1898Benda-线粒体1898Golgi-高尔基体,39,2020/5/30,(三)实验细胞学时期(19001943年),采用实验手段，综合研究细胞的生理功能，生化变化和发生发展过程。1902Boveri，Suttan染色体遗传理论1910Morgen基因学说1909Harrison组织培养1943Cloude高速离心提取细胞器1924FeulgenFeulgen染色测定DNA1940BrachetUnna染色测定RNA1940Casperson紫外分光光度法检测DNA,40,2020/5/30,1932年，德国人M.Knoll和E.A.F.Ruska发明电镜，1940年，美、德制造出分辨力为0.2nm的商品电镜。1944Avery-DNA是遗传物质1953Watson，Crick-DNA双螺旋模型目前，细胞生物学与分子生物学的结合愈来愈紧密，基因调控、信号转导、细胞分化和凋亡、肿瘤生物学等领域成为当前的主流研究内容。,TEM,(四)细胞和分子生物学形成和发展时期(1944年-),41,2020/5/30,具有抗凝血功能的组织工程化血管支架,苏州同科生物材料有限公司,42,2020/5/30,Giveamanafishandyoufeedhimforaday.Teachamantofishandyoufeedhimforalifetime.,44,2020/5/30,学习细胞生物学的方法,掌握基本概念掌握形态结构（微观、亚微观、分子）掌握功能,45,2020/5/30,内容目录,46,2020/5/30,参考目录,47,2020/5/30,48,2020/5/30,学时安排：理论：34学时实验：8学时考试安排：理论：80%实验：20%,49,2020/5/30,细胞生物学技术,显微镜技术细胞化学技术细胞纯化和分析技术细胞培养,50,2020/5/30,基本概念：分辨率（resolution,resolvingpower)：是将邻近两点清晰区分辨认的能力。肉眼的分辩率：0.10.2mm光镜的最大分辨率：0.2m电镜的分辨率：0.140.2nm,显微镜技术,51,2020/5/30,一、光学显微镜（Lightmicroscope,LM,简称光镜),是使微小物体或物体微细部分的像放大，以便观察的光学仪器显微镜的放大倍数目镜放大倍数物镜放大倍数,52,2020/5/30,简介几种类型显微镜：普通光学显微镜相差显微镜倒置显微镜荧光显微镜激光共聚焦显微镜,53,2020/5/30,普通光学显微镜,54,2020/5/30,55,2020/5/30,56,2020/5/30,相差显微镜(phase-contrastmicroscope),1932年德国物理学家FritzZernicke在研究天文望远镜的镜面时，发现了相差理论，即光线通过不同密度的物质时，其滞留程度不同，通过密度大的物质，光滞留时间长；密度小的物质，光滞留时间短。该理论应用于显微镜，发明了相差显微镜。,57,2020/5/30,相差显微镜与普通光镜的主要区别：是在物镜后装有一块“相差板”，将“相位差”或“光程差”转换成可观察的“振幅差”，结果明暗结构清晰。可直接观察活细胞，细胞中致密结构，在成像中看起来较深、较黑，细胞呈现立体感。一般实验室里用的是倒置相差显微镜(invertedphase-contrastmicroscope),58,2020/5/30,倒置显微镜,实际上是倒置相差显微镜。观察活的培养细胞的微细结构和变化。,59,2020/5/30,60,2020/5/30,61,2020/5/30,倒置相差显微镜下细胞形态,普通光镜下细胞的形态,62,2020/5/30,激光共聚焦显微镜（laserscanningconfocalmicroscope),可获得细胞结构的三维图像用单色激光作光源，使样品激发出荧光移动载物台（微量步进马达），改变焦平面，将不同层面的光切面图像输入计算机，用计算机处理图像，可得到一定厚度样品的三维立体结构的荧光图像。,63,2020/5/30,仪器型号：BioRad1024,64,2020/5/30,Doubleimmunofluorescencefor(23-cyclicnucleotide-3-phosphodiesterase)CNPase(red)andTNF(green)examedbyconfocalmicroscopydemonstratedtheco-localization(yellow)ofmurinetransgeneinCNPasepositivecells.,65,2020/5/30,66,2020/5/30,二、电子显微镜(electronmicroscope),利用高速运动的电子束代替光波的一种显微镜,67,2020/5/30,68,2020/5/30,69,2020/5/30,细胞化学技术：是在保持细胞结构完整的条件下，借助细胞中的化学反应，定性或定量分析细胞的显微或超微结构的化学组成及定位。细胞化学技术类型：酶细胞化学(enzymecytochemistry)免疫细胞化学(immunocytochemistry)放射自显影(autoradiography),细胞化学技术,70,2020/5/30,酶细胞化学(enzymecytochemistry),定义：通过酶的特异细胞化学反应来显示酶在细胞内的分布及酶活性强弱的方法。,71,2020/5/30,原理：,细胞内的酶与底物相互作用，用捕捉剂捕捉酶与定位的作用产物，使之在显微镜下可见。,底物,H3PO4,eg:1、酶与底物相互作用,2、加捕捉剂，如Pb2,电子密度高，电镜下可定位酶,72,2020/5/30,放射自显影(autoradiography),利用放射性样品自身发出的射线，使核乳胶或X线片感光来测定放射性物质的分布或量的方法。该方法具有灵敏度高的优点，便于分析标记物质不同时期在不同组织细胞中的吸收、转运、储存及排除的动态关系。,73,2020/5/30,免疫细胞化学(immunocytochemistry),定义：利用免疫学抗原抗体反应的原理，通常用荧光素、辣根过氧化物酶、铁蛋白或胶体金等标记已知的抗体，再与组织细胞内特定抗原结合，使之在显微镜下可见，从而对组织细胞抗原进行定性、定位和定量研究的技术。,74,2020/5/30,常用的几类标记,荧光标记：FITC（异硫氰酸荧光素）绿色荧光Rohdamin（罗丹明）红色荧光Acridineorange（丫叮橙）DNA绿RNA红Ethidiumbromide（嗅化乙啶）篮色荧光,75,2020/5/30,酶标记Horseradishperoxidase,HRP（辣根过氧化酶）HRP+H2O2+DAB(氨基联苯胺)棕色+锇酸锇黑铁蛋白标记一种含铁离子的蛋白铁离子在电镜下电子密度高,76,2020/5/30,胶体金标记是金元素的悬浮液，金颗粒在悬浮液中很稳定金颗粒表面带负电荷，可与蛋白质形成稳定的复合物，金颗粒在电镜下电子致密、深染。胶体金也可与酶结合，标记酶后，检测酶相应底物。,77,2020/5/30,直接法,是最早的方法，用标记的特异性抗体，直接检测细胞或组织中相应抗原的方法。优点：特异性强和简便迅速。缺点：敏感性较差，难以检测低浓度的抗原。,78,2020/5/30,间接法,79,2020/5/30,80,2020/5/30,81,2020/5/30,细胞及其组分的分离纯化和分析技术,一、流式细胞技术（FlowCytometry,FCM),二、细胞分级分离(cellfractionation),82,2020/5/30,一、流式细胞技术（FlowCytometry,FCM)是用流式细胞仪(flowcytometer)对细胞或亚细胞结构进行快速测量的新型分析技术和分选技术。流式细胞仪又称荧光激活细胞分类仪(FluorescenceActivitedCellSorter,FACS),83,2020/5/30,流式细胞计主要由四部分组成：,(1)流动室和液流系统：流动室由样品管、鞘液管和喷嘴等组成，(2)激光源和光学系统：经特异荧光染色的细胞需要合适的光源照射激发才能发出荧光供收集检测。常用的光源有弧光灯和激光；激光器又以氩离子激光器为普遍，也有配和氪离子激光器或染料激光器。,84,2020/5/30,(3)光电管和检测系统：经荧光染色的细胞受合适的光激发后所产生的荧光是通过光电转换器转变成电信号而进行测量的。光电倍增管(PMT)最为常用。(4)计算机和分析系统：经放大后的电信号被送往计算机分析器。,85,2020/5/30,流式细胞技术特点：,测量速度快。最快可在1秒种内计测数万个细胞；可进行多参数测量。可以对同一个细胞做有关物理、化学特性的多参数测量，并具有明显的统计学意义；是一门综合性的高科技方法。它综合了激光技术、计算机技术、流体力学、细胞化学、图像技术等从多领域的知识和成果；既是细胞分析技术，又是精确的分选技术。,86,2020/5/30,二、细胞分级分离(cellfractionation),细胞分级分离：是研究细胞内细胞器和其它各种组分的化学性质和功能的重要方法。细胞分级分离的基本步骤：匀浆，制备单细胞悬液细胞的分级分离(cellseparation)细胞纯化(cellpurification),87,2020/5/30,细胞分级分离过程必须遵守的几个基本原则：分离体系所用的溶液必须是等渗的。分离体系应保持低温，以降低细胞的代谢活动。无菌操作。,88,2020/5/30,离心是细胞分级分离的重要手段之一离心的方法：差速离心法速度区带离心法等密度离心,89,2020/5/30,90,2020/5/30,一、差速离心法differentialcentrifugation,原理：由低速到高速逐渐沉降将不同大小的颗粒分离。,细胞核,线粒体等,微粒体,核糖体等,差速离