高效液相色谱简介及操作PPT课件

.,1,高效液相色谱High-PerformanceLiquidChromatography，HPLC,.,2,高效液相色谱概述及原理,主要注意事项,基本操作步骤,高效液相色谱仪的结构,主要内容,1,2,3,4,.,3,一、高效液相色谱概述及原理,高效液相色谱法（HPLC）是在20世纪70年代在经典液相色谱和气相色谱的基础上迅速发展起来的一种高效、快速的分离分析技术。,.,4,1.色谱的演化,色谱：由于不同的组分与固定相作用强弱不同，在一定的推动力下，它们在固定相中滞留的时间长短不一，从而使它们按一定顺序从色谱柱中先后流出。,经典的柱色谱,经典的柱色谱,.,5,渐渐地，人们以传统色谱为蓝本开发了气相色谱,气相色谱示意图,经典的柱色谱,.,6,高效液相色谱：效仿气相色谱，用高压输液泵将流动相输入高柱效色谱柱，使其在柱内快速流动，并在柱末端附加检测器检测分离情况。高效液相色谱就这样诞生了。,.,7,高效液相色谱仪就这样诞生了,LC,GC,HPLC,.,8,填料颗粒小（210m），受到的阻力较大，为了能迅速地通过色谱柱，必须对载液施加1530MPa的高压。,由于采用高压，载液在色谱柱内的流速可达l10mLmin，因而所需分析时间少。,使用细、规则、孔浅的颗粒做为固定相，分离效率大大提高。,采用紫外、荧光、蒸发激光散射、电化学、质谱等检测器，检测灵敏度高。紫外检测器检测限可达0.01ng；荧光和电化学检测器可达0.1pg。,2.为什么叫高效液相色谱?,.,9,HPLC和经典液相色谱法的比较,.,10,3.高效液相色谱法的分类,通常将液相色谱法按分离机理分成吸附色谱法、分配色谱法、离子色谱法和凝胶色谱法四大类。,.,11,4.如何阅读色谱图？,tR：保留时间；tM：死时间；：调整保留时间；W：峰宽,.,12,定性分析：在同一色谱系统中相同物质具有相同的保留值定量分析：组分含量与其响应值（峰高或面积）成正比,.,13,5.如何评价色谱峰？,柱效：描述被分离组分的集中程度。柱效越高，组分越集中，对应色谱峰的峰宽越窄。可用理论塔板高度H描述。H越小，柱效越高。选择性：描述不同组分的分离程度。选择性越高两个色谱峰顶相距越远。用R表示,.,14,（a）柱效和分离度都不好；（b）分离度高，柱效低；（c）理想色谱峰,.,15,用分离度R可以描述选择性和柱效的总效能,R值越大，表明两组分的分离程度越高，R=1.0时，分离程度可达98%，R1.0时两峰有部分重叠，R=1.5时，分离程度达到99.7%.所以，通常用R=1.5作为相邻两色谱峰完全分离的指标.,.,16,分析未知物质-联用技术,色谱-质谱联用色谱-核磁共振联用色谱-傅氏转换红外线光谱分析仪联用,.,17,二、高效液相色谱仪的结构,液相色谱仪由高压输液系统、进样系统、分离系统以及检测和记录系统四大部分组成。此外，可根据需要配置流动相在线脱气装置、梯度洗脱装置、自动进样系统、柱后反应系统和全自动控制系统等。,高效液相色谱仪结构流程图,.,18,.,19,1高压输液系统,高压输液系统有贮液器、高压泵及压力表等组成，核心部件是高压泵。,（1）贮液器,流动相贮液器，一般由玻璃、不锈钢或聚四氟乙烯塑料制成，常用体积为0.52L。,流动相溶剂放入贮液器之前必须经过过滤和脱气处理。,常用脱气方法：超声脱气、加热脱气、真空脱气、吹氮脱气等。,.,20,（2）高压输液泵主要部件之一，泵的性能好坏直接影响到整个系统的质量和分析结果的可靠性，常用的压力范围：(150350)105Pa。,输液泵应具备如下性能：,流量稳定；流量范围宽；输出压力高；液缸容积小；密封性能好，耐腐蚀。,.,21,高压泵的分类,往复式柱塞泵,分类,恒流泵,恒压泵,螺旋注射泵,柱塞往复泵,隔膜往复泵,.,22,2进样系统,进样方式：注射器进样、阀进样、自动进样。早期使用注射器进样，现在大都使用耐高压的六通阀进样或自动进样。,.,23,六通阀的结构：,.,24,色谱柱,是高效液相色谱的心脏。,柱管多用不锈钢制成。两端的柱接头内装有筛板，防止填料漏出。填料的粒度多为0.2-20m(5-10m)。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。常规分析柱：内径25mm(常用4.6mm，3.9mm)，柱长1030cm(15cm，25cm居多）。,3分离系统,包括色谱柱、恒温器和连接管等部件。,.,25,4检测系统,主要作用：监测经色谱柱分离后的组分浓度变化，并由工作站记录数据，定性、定量分析。,高效液相色谱常用的检测器有紫外检测器、示差折光检测器和荧光检测器等。,.,26,原理：朗伯-比尔定律,a.紫外检测器(UVD)：应用最广泛的检测器。,特点：使用面广；灵敏度高（检测下限为10-10gml）；线性范围宽；对温度和流速变化不敏感；可检测梯度溶液洗脱的样品。,缺点：只能检测有紫外吸收的物质，流动相的截止波长应小于检测波长。,.,27,b.示差折光检测器(RID),原理：监测参比池和测量池中溶液的折射率之差来测量试样浓度。,特点：通用性检测器；对温度变化比较敏感，要保持在0.001；灵敏度低(10-6g)；对溶剂变化敏感，不适用于梯度洗脱。,凡具有与流动相折光率不同的样品组分，均可使用示差折光检测器检测。目前，糖类化合物的检测大多使用此检测系统。,.,28,c.荧光检测器(FLD),原理:某些溶质在紫外光激发后能发射可见光(荧光)的性质检测。特点:选择性检测器，灵敏度比紫外检测器高2-3个数量级，可达到10-12g；选择性好，对流量和温度敏感性低。缺点：只适合于能产生荧光的物质的检测。,只适用于具有荧光的有机化合物（如多环芳烃、氨基酸、胺类、维生素和某些蛋白质等）的测定。,.,29,d.蒸发光散射检测器(ELSD),通过检测光散射程度而测定溶质浓度的检测器。,工作原理:,适用检测挥发性低于流动相的组分，主要用于检测糖类，高级脂肪酸，磷脂，维生素，氨基酸，甘油三酯及甾体等。,适用范围：,.,30,5数据处理系统,该系统可对测试数据进行采集、贮存、显示、打印和处理等操作，使样品的分离、制备或鉴定工作能正确开展。,.,31,三、高效液相色谱基本操作步骤,（1）检查电源线连接是否正确后打开电源开关（2）泵体及流路内的气泡排除（3）正确连接色谱柱注意流向标志，切勿反接,.,32,（4）系统平衡第一步：先用甲醇或乙腈冲洗流路约20分钟，平衡活化色谱柱，并赶走管路中的杂质和水分。第二步：平衡色谱柱方法一：若流动相为有机相与水相的混合物，则第一步完成后，按照分析样品的需要调节有机相与水相的比例后冲洗流路约30分钟后，待基线走平后即可进样。方法二：若流动相中含有缓冲盐溶液、有机/无机酸，则第一步完成后，先用95%的去离子水冲洗流路约20分钟后，再按照分析样品的需要调节流动相的比例，冲洗流路约30分钟，待基线走平后即可进样。,.,33,（5）色谱柱平衡后，打开检测器（开灯）（6）测定样品（7）清洗仪器色谱柱及流路清洗进样阀清洗进样针清洗,.,34,四、主要注意事项,1泵使用的注意事项,防止任何固体微粒进入泵体（用0.22um或0.45um的微孔滤膜过滤）流动相不应含有任何腐蚀性物质，含有缓冲盐的流动相不应保留在泵内更不允许留在柱内。泵工作时防止溶剂瓶内的流动相用完，否则空泵运转一是会使大量空气进入柱内柱床崩塌、也会磨损柱塞、密封圈，最终产生漏液。输液泵的工作压力决不要超过规定的最高压力。流动相应先脱气，以免在泵内产生气泡，影响流量的稳定性和分析结果。,.,35,2色谱柱使用的注意事项,3其他注意事项,色谱柱在任何情况下不能碰