细胞培养的设施与基本条件6课时

第二章细胞培养的设施和基本条件，山东师范大学生命科学学院杨桂文，第一节概要，1 .细胞培养是什么？ 细胞培养是组织培养的一种形式，组织培养(tissueculture )这一习惯是指所有体外培养，即器官培养、组织培养和细胞培养的总称。 其意图是从活体中取出组织和细胞，模拟生物体内的生理条件，在体外建立无菌、温和的一定营养条件等，使其生长生存，维持其结构和功能的技术。 体外培养的种类、细胞培养：将组织块机械地或酶性地分离成单一细胞，作为细胞悬浊液，在固体基质上培养，作为单层细胞生长，在培养液中悬浊状态下培养的技术叫做细胞培养。 有标准化工作方法的培养用液体极多(如培养液、胰蛋白酶、HANKS液和抗生素等)，负责人应负责，按规定处理，保证浓度准确，灭菌可靠，所有制备的溶液瓶均须注明姓名、浓度、消毒的有无和生产日期等。 所有培养用品都要有一定的保管场所，不要乱放。 其中特别重要的是，培养用品和非培养用品要严格分开，消毒品和未消毒品要分别保管。 2、细胞培养工作方法，第二节细胞培养的实验条件，第一、实验室计划，核心部分：准备室、缓冲室、培养室、消毒和实验前准备室实验后污垢的处理和清洗，1、准备室、准备室是培养器具的清洗、消毒和实验准备的场所，一般建设在通风和光线充足的场所。 水槽2处：实验后的清洗和清洗液浸渍后的清洗。 盛清洗液的陶瓷缸或玻璃缸。 清洗后的器皿的凉爽架和储藏箱。 高温干燥消毒箱和高压蒸汽消毒锅。 消毒后器具的冷架和储藏箱。 重水装置。 准备电炉桌子污物桶、室内常用设备，2、缓冲室、养护箱离心分离机显微镜更衣室、操作室的无菌环境，避免空气对流。 3、培养室、培养室的设计；培养室的位置设置在阴面，设置在阳光不直接照射的地方，防止室内温度升高。 顶棚高度不超过2米，保证紫外线灯的有效杀菌效果，门一般用拉门防止空气流动。 为了使天花板、地板和周围的墙壁光滑无死角，设计了涂瓷砖和油漆。 一个容易清洗和消毒，墙角不容易积尘。 培养室内的无菌操作要点紫外灯在没有人的时候必须点亮进入无菌室必须穿无菌服， 应戴帽子和口罩每周清洗消毒使用的物品应以外科手术方式严格消毒室内柜台应清洁使用的物品应一次准备好瓶口应用酒精炎消毒进出尽量减少。 培养室最核心的设备是洁净工作台、二、实验设备、洁净工作台、水平送风方式的垂直送风方式，在使用洁净工作台时应注意的点洁净工作台优选设置在洁净室内，优选隔离在洁净室内，灰尘堵塞过滤器新设置或长期不使用的工作台，作业前必须用真空吸尘器或不产生纤维的工具清扫工作台和周围环境，用药物灭菌法或紫外线灭菌法进行灭菌处理。 每次使用工作台时，请用75%酒精擦拭工作台，预先用3050min紫外线灭菌灯处理作业区域内蓄积的微生物。 关掉紫外线灯后，启动送风机2分钟后进行培养操作。 为了维持清洁的气流型，请勿在作业区域内保管不需要的物品。 通常，高效滤波器每三年更换一次。 更换高效过滤器时，请委托专家操作以保持密封良好。定期取下粗过滤器的布(无纺布)的清洗，根据环境的清洁，通常每隔36个月进行一次。 每次使用清洁工作台时，立即清除桌子上的东西，把桌子擦干净。 CO2培养箱一定浓度的CO2对细胞的生长，特别是原代培养和单细胞培养有促进作用(5% )。 一定浓度的CO2可使培养液的pH保持一定。 适合开放培养，培养箱封口后可在一般恒温培养箱内培养，但用培养皿或多孔板培养时，需要高湿度和高CO2含量的空气。 提高湿度，在容器中加入水浴，可以保证培育箱内的湿度。 孵化器内置紫外线灯。 气体流量计可调节CO2与空气的比率。 水中可加入防腐剂(二氧乙酸)。 在CO2孵化器中可以防止湿度高，容易发霉。 电热干燥盒用于干燥和干热消毒玻璃器具。 消毒时，温度高达160，玻璃器具不可随意打开箱子门，以免突然接触到冷空气而破裂。 在温度下降到50以下之前不能打开箱门。 蒸汽消毒器、冰箱、超低温冰箱、家用冰箱、离心机、真空泵、纯水设备、过滤器、液氮容器、显微镜、天平、检测器、三、检测器具和器具，常用手术器具有解剖刀、白内障刀、解剖修剪、眼科修剪、镊子、蚊钳、针保持器、止血钳等。 使用各种金属器具后，应立即清洗干净，用干净的棉球晾干，以免生锈。 金属器具，培养瓶玻璃瓶底盘吸管吸瓶消毒筒均化器，玻璃器，其他杂货喷水器，煮沸锅，铝便当盒，橡胶塞，橡胶盖。 第三节清洗和消毒，第一、清洗，1玻璃器具的清洗，浸渍刷洗酸浸渍清洗，新购入的玻璃器具始终带有灰尘，呈弱碱性，或者带有铅、砷等有害物质，因此用自来水浸渍一夜，水洗，然后用2%5%盐酸浸渍一夜或煮沸30分钟要领：培养后的玻璃器皿应立即浸在水中，以便下一次刷牙能够顺利进行。 使用后的玻璃器具上附着了很多蛋白质，干燥后很难洗掉，使用后请立即用水浸泡。 浸泡后，用柔软的刷子、优质的洗涤剂将容器上的垃圾洗掉晾干。 要领：如果浸渍的玻璃器皿上用刷子沾上洗涤剂洗涤器皿上的垃圾的次数过多，器皿的表面粗糙度就会受损，洗涤剂有使pH值上升的倾向，因此容易选择柔软的刷子和优质的洗涤剂。 禁止去除污垢。 因为它含有沙粒。 严重损坏玻璃器皿的粗糙度。 尤其要注意刷瓶子的角部。 在酸浸泡之前必须冲洗洗涤剂。 刷洗后，将容器浸入清洗液24h中，即使有急事也必须在4h以上。 洗涤液由重铬酸钾、浓硫酸和蒸馏水制备，具有强氧化作用，去污能力强。 浸入清洗液后，用残留在玻璃容器中的刷子冲洗的微量杂质将被完全除去。 酸浸渍，(1)清洗液的配方，优选选择耐酸性塑料罐或不锈钢罐配制。 首先把重铬酸钾溶解在水中(用玻璃棒熔化，有时不能完全熔化)。 慢慢加入浓硫酸，过快会发热危险(浓硫酸中不能加入重铬酸钾)。 清洗液呈茶色红色，绿色表示故障。 洗涤液腐蚀性非常强，调配和应用应注意和保护。 洗涤液的使用注意事项，(2)将硅酸钠洗涤液贮存液(100 )硅酸钠80g和偏磷酸钠9g加热溶解于1000ml水中。 使用时用水稀释100倍，将器皿放入煮沸20min，冷却后洗涤，再用2%HCl浸泡2h后，用自来水洗涤。 硅酸钠清洗液比清洗液安全，但价格高。 用自来水充分冲洗，用吸管等冲洗10min的瓶子，一个个装满，倒下来，要重复10次以上。 之后，用蒸馏水过三次，不留死角。 晒晒晒。洗净、自来水充分浸渍洗净2%Na0H浸渍一晚自来水洗净2%5%盐酸浸渍30min自来水洗净蒸馏洗净3次干燥灭菌、2塑料器洗净、3橡胶等橡胶类处理，新购买者按自来水洗净2%NaOH煮沸15min自来水洗净2%5%HCl煮沸15min自来水洗净5次以上蒸或者用蒸馏水洗干，整齐地排列在小型的金属箱中，进行了101.3kPa的高压灭菌。 4金属器械清洗，新购的金属器械常涂防锈油，用加汽油的纱布擦去油脂，然后用水清洗，最后用酒精棉球擦去，晾干。 用过的金属器具，先用水煮沸消毒，然后擦干净。 使用前用蒸馏水煮沸10min，或包装后用101.3kPa高压15min。 5除菌过滤器的处理，使用过的过滤器除去过滤器，剩下的液体用三蒸水充分洗净，放入干燥箱内干燥。 二、包装、包装的目的是为了防止消毒灭菌后再次被污染，对晾干的器材应严格包装后再进行消毒灭菌处理。 三、消毒灭菌、一干热灭菌适用于玻璃器具消毒，160170、90120min或1804560min。 优点：使用方便，消毒后容易干燥、保存。 缺点：干热传导慢，需要很长时间。 2蒸汽灭菌用于玻璃制品、过滤器、橡胶塞、解剖器具、耐热塑料器具、热不变的溶液等，物品的有效灭菌压力和时间不同，如培养液、橡胶制品、塑料容器等68kPa(115)、10min； 布类、玻璃制品、金属机器等103kPa(121)、15min。 优点：消毒效果好，时间短。 缺点：需要负责人监督，不要离开人。 任何时候都要注意压力的变化。 防止事故。 3过滤除菌，该方法适用于多种细胞培养用液如培养液、消化液、Hanks液、血清和其他高压蒸汽消毒不能消毒的液体。 孔径为0.22的微孔过滤器可以去除细菌和霉菌等。过滤除菌装置、4紫外线适用于无菌室、超清洁工作台的消毒。 紫外线波长200300nm，最强254nm，615平方米紫外线灯最低，高2.5m以下，湿度45%60%，杆菌效果好，球菌、霉菌、酵母菌最低，实验前照射时间30分钟以上。 优点：消毒效果好，质地大，使用方便。 缺点：产生臭氧，气味难闻。 5熏蒸消毒适用于无菌室等房间的消毒。 将高锰酸钾57.5g、甲醛(40%)1015ml混合放入开放容器内，可立即看到白色甲醛烟，消毒室须关闭24小时，减少4小时以上。 6煮沸消毒，金属器械和橡胶塞用水煮2030分钟，趁热冲水即可使用。 紧急情况下使用。 7化学消毒、化学药品消毒灭菌法是用杀微生物的化学制品进行消毒灭菌的方法。 实验室地板、桌子、器具及洗手用溶液均用化学药品消毒杀菌。 2%煤酚皂溶液(lesser )0. 25 %的钕会消除1%水银35%甲醛溶液75%的酒精。 第四节培养用液和培养基除了细胞培养所必需的培养基之外，还使用水、平衡盐溶液、消化液、缓冲液等各种液体。 在组织培养中对这些液体有一定的要求。 另一方面，水、组织培养用的各种液体都是用水制备的，对水的质量要求很高，水中含有杂质会对细胞产生不良影响，具有有毒的特质和元素。 即使含量极少，也有可能引起细胞中毒而死亡。 因此，组织培养用水需要高度纯化。 二、平衡盐溶液(BSS )、平衡盐溶液(BSS )主要由无机盐和葡萄糖组成，是细胞培养中常用的基本培养液，可维持渗透压，调节pH值，提供细胞生存所需的能量和无机离子成分。 主要作为合成培养基(液)的基础液，清洗组织、细胞等。平衡盐溶液的主要成分无机盐：无机盐不仅是细胞生命所必需的成分，在维持渗透压、缓冲和调节溶液酸碱度方面也起着重要作用。 葡萄糖：供给能源用。 酚红：酸碱度变化的指示剂。 酸：黄色中：桃红色碱：紫红色。 平衡盐溶液的作用作为稀释和注入的液体，维持细胞渗透压。 提供培养液酸碱度保持在培养细胞生理范围内的缓冲系统。 提供细胞正常代谢所需的能量、水分、无机离子。 用于清洗组织和细胞。 制备各种培养液的基础溶液。 常用的几种平衡盐溶液，由Hanks液A.10母液制备法国液：取450ml三蒸水，依次溶解下列试剂NaCl 80 g KCl4GGG so 47 h2o2g CaCl 21.4 g (2h2o者1.85g )后，再补充三蒸水至500ml。 乙液：取出三蒸水450ml，依次溶解下列试剂Na2HPO40.6g(12H2O者1.52g)KH2PO40.6g的葡萄糖10g0.4%酚红50ml后，补充三蒸水500ml。 B.Hanks使用液的制备将上述甲、乙液等量用三蒸馏水稀释10倍，制成使用液。 用前高压灭菌。 另外，Earle液一般认为Earle液比Hanks液缓冲能力强，但Earle液需要在不使用橡胶塞的容器上安装CO2平衡(利用5%CO2气体平衡)，其配合方法为a .甲液(10 ) 配合法NaCl 68.0 gkcl 4.0 GM GSO 47 H2O 2.0 GNA H2 po4H2O 1.4 g葡萄糖10.0g三蒸馏水800ml苯酚红(0.4%)100mlB .乙液(10 )配合法CaCl22.0g三蒸馏水100ml，甲液和乙液为67.6kPa c .使用液的调制在储藏液1份中加入3蒸水9份稀释后，装上瓶塞，标明显示，用67.6kPa的高压灭菌保存在15min、室温或4下。 临时以7.5%NaHCO3调整至所需pH。 PBS液为0.85%NaCl、pH7.2的PBS (简称ph7.2PBS ) a.PBS贮存液的制备方法(10 ) NaCl8.5gkcl0.2GNA2hpo 412 h2o2. 85 g (或Na2HPO42H2O1.13g ) 在使用KH2PO40.27g三蒸水100mlB.PBS的调制储存液50ml中加入三蒸水450ml完成，在103kPa(121.3)15min下灭菌，在室温或4下保存。 平衡盐溶液调制的注意事项试剂应按照纯优先级纯(GR )绿色分析纯(AR )红色化学纯(CP )蓝色生物试剂(BR)药品顺序溶解。 灭菌时的压力为10磅，不得超过1015分钟。 CaCl和MgSO4易潮解(不能使用潮解)。 三、消化液主要用于分离组织和分散细胞，常用胰蛋白酶(0.25% )和乙烯四乙酸钠(EDTA )两种溶液。 1胰蛋白酶溶液、胰蛋白酶溶液的制备：用少量的D-Hanks液补充使胰蛋白酶粉成糊状的D-Hanks液，振荡混匀，在4的冰箱中过夜溶解后，用滤纸过滤滤液用玻璃过滤器过滤，分成小瓶放入，冷冻保存低温冰箱和普通冰箱2EDTA溶液为化学螯合剂，对细胞有一定的解离作用，毒性小，使用方便。 使用浓度为0.02%，用D-Hanks溶液溶解后，用10磅15分钟高压灭菌，分装瓶，在4冰箱中保存。 常用三种浓度：四、pH调节液、1.NaHCO37.4%、5.6%、3.7%。 制备方法：三蒸水溶玻璃滤器过滤除菌分注4冰箱保存备用。 使用时请滴下，有时搅拌。 2HEPES (羟乙基乙二胺乙磺酸)为氢离子缓冲剂，可长时间控制一定的pH范围，使用浓度一般为10-