α-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测

酶作为生物催化剂,具有专一性和高效性。现在被大量使用在食品、化工、医药等领域。然而，在应用酶的过程中，人们也发现了一些实际问题：（1）在水溶液中不稳定：酶通常对强酸、强碱、高温和有机溶剂等条件非常敏感，容易失活；（2）不利于工业化使用：溶液中的酶很难回收，提高了生产成本，也可能影响产品质量。,怎样解决这些问题呢？,固定化酶技术,固定化酶,1、概念：,将水溶性的酶用物理或化学的方法固定在某种介质上，使之成为不溶于水而又有酶活性的制剂。,2、优点：,酶不溶解在催化反应的溶液中，产物更易纯化；固定化酶可反复使用，更经济，更利于工厂化生产；固定化酶提高酶的稳定性，可较长时间贮存和使用；,3、方法：,吸附法、共价偶联法、交联法、包埋法,4、机理：,将固定化酶装柱，当底物经过该柱时，在酶的作用下转变为产物。,固定化酶,固定化酶的用途,在工业上的应用：柚苷酶固定化酶用于果汁脱苦；木瓜蛋白酶固定化酶用于啤酒澄清；葡萄糖异构酶固定化酶用于制造果糖，提高甜度。,在化学分析和临床诊断上的应用：用脲酶固定化酶测定血液或尿中的尿素含量。,在医药上的应用：将苯丙氨酸羟化酶及其辅酶制成不溶酶，注射到患者体内，可有效治疗苯丙酮尿症。缺少乳糖酶，不能水解牛乳中的乳糖，引起腹痛腹泻，可用乳糖酶固相酶在体内或体外水解乳糖。,(一)吸附法,物理吸附法,离子结合法,通过氢键、疏水键等作用力将酶吸附于固体吸附剂的方法。如有机硅胶、活性炭和石英砂等,利用酶的两性基团和离子交换剂的相互作用（离子键）,吸附法是将酶与吸附剂接触，再经洗涤除去未吸附的酶便能制得固定化酶。,(二)包埋法,将酶包埋在多孔载体中，包埋成格子型或包埋成微胶囊型。,它的原理是酶蛋白的一些基团，在温和的条件与载体共价结合，形成共价键，从而被固定化。,(三)共价偶联法,酶分子和多功能试剂之间形成共价键及酶蛋白的氨基相连得到三维的交联网状结构。,(四)交联法,比较1：,适用的酶范围广，酶活性高,适用范围广，结合稳定,酶活性高，稳定性也较高,酶与载体结合力较弱，酶容易脱落,制备条件不够温和，酶活性较低,适用范围窄,催化效率高，低耗能，低污染等,对环境条件非常敏感，容易失活；,一种酶只能催化一种化学反应，而在生产实践中，很多产物的形成都是通过一系列的酶促反应才能得到的,溶液中的酶很难回收，不能被再次利用，提高了生产成本；,反应后酶会混在产物中，可能影响产品质量,酶既能与反应物接触，又能与产物分离,固定在载体上的酶还可以被反复利用,比较2：,实验6-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测,实验目的(1)制备固定化-淀粉酶(2)进行淀粉水解的测定,一、实验原理,淀粉,糊精,遇碘显蓝色,用吸附法将-淀粉酶固定在石英砂上。,遇碘显红色,5ml塑料注射器、50ml烧杯、滴管、自行车用气门芯及夹子、注射器架、试管或微量离心管3支,二、设备及用品,（1）-淀粉酶的固定化：,三、实验材料及其制备,在烧杯中加入5mg-淀粉酶溶于4ml蒸馏水中,加入5g石英砂，不停搅拌,30min后装入注射器（注射器下端接有气门心并用夹子封住）,10倍体积的蒸馏水洗涤,注意：冲洗时流速为1ml/min。,除去未吸附的游离淀粉酶,使-淀粉酶与石英砂充分接触，有利于酶的固定化,反应柱,反应柱能连续使用半年，大大降低了生产成本，提高产量和质量。,你认为反应柱有什么优点？,（2）可溶性淀粉溶液：（3）5mmol/LKI-I2溶液,50mg可溶性淀粉溶于100ml热水中，搅拌均匀。,0.127g碘+0.83g碘化钾+蒸馏水100ml,完全溶解后装瓶。,三、实验材料及其制备,将注射器固定在注射器架上,滴管滴加淀粉溶液,流速0.3mL/min,流出5ml后接收0.5mL(约10滴)流出液,加入12滴KI-I2溶液,用水稀释1倍后观察颜色,实验后,10倍柱体积蒸馏水洗涤此柱,放置在4冰箱中,几天后重复实验，观察结果,四、实验步骤,控制流速,1.水+指示剂2.淀粉溶液+指示剂：3.亲和层析洗脱液+指示剂：4.贮于冰箱几天后重复实验：,呈蓝色,呈红色,呈红色,五、实验结果,1、如何证明洗涤固定化淀粉酶柱的流出液中没有淀粉酶？,答：可在试管中加入1ml可溶性淀粉溶液，再加入几滴淀粉酶柱的流出液，混合后加入1滴KI-I2指示剂，如仍显蓝色，即流出液中没有淀粉酶了。,六、思考与讨论,2、试验中为什么要待固定化酶柱中流出5ml液体后再接收流出液用于鉴定？,答：因为固定化酶柱中的酶与流经柱子的淀粉反应需要一定的时间，刚开始流出的液体中由于反应时间过短，糊精未生成或生成的量太少，所以不利于后面的颜色鉴定。,六、思考与讨论,3、耐高温的淀粉酶有哪些可能的用途？,答：寻找耐高温的淀粉酶的目的是在高温下使淀粉水解快，而且酶不会因高温而在短时间内变性。在发酵生产中使用的往往是植物淀粉，如青霉素发酵、乙醇发酵等都要水解淀粉，所以耐高温淀粉酶用途广泛。,六、思考与讨论,【2015绍兴联考】请回答下列问题：(1)将-淀粉酶溶于水中，再加入石英砂，不时搅拌，这样-淀粉酶就可以固定在石英砂上。这种固定化的方法称为_。30min后，装入反应器中，构成固定化酶反应柱，并用10倍体积的蒸馏水洗涤此反应柱，洗涤的目的是_。洗涤时，蒸馏水流速_(填“能”或“不能”)过快。(2)实验时，将此反应柱固定在支架上，用滴管滴加可溶性淀粉溶液，并以0.3mL/min的流速过柱，控制流速的目的是_。流出5mL后接收0.5mL流出液，加入12滴_，观察颜色。为了能使观察到的颜色变化明显，可_后再观察。如果溶液呈红色，说明淀粉水解成为_。(3)实验后，用10倍柱体积的蒸馏水洗涤此反应柱，洗涤的目的是_。洗涤后，放置在4冰箱中保存。,七、练习巩固,吸附法,糊精,稀释,除去未吸附的游离淀粉酶,不能,使淀粉溶液与溶粉酶充分接触充分反应,KII2溶液,稀释,洗去残留的反应物和产物,【2014高考】下面是关于固定化酶和细菌培养实验的问题。请回答：(1)某兴趣小组欲利用固定化酶进行酶解淀粉的实验，分组见上表。将吸附了淀粉酶的石英砂装入柱中后，需用蒸馏水充分洗涤固定化酶柱，以除去_。按上表分组，将配制好的淀粉溶液加入到固定化酶柱中，然后取一定量的流出液进行KI-I2检测。若流出液呈红色，表明有_生成；若各组呈现的颜色有显著差异，则流出液中淀粉水解产物浓度最高的是_组。,七、练习巩固,未吸附的淀粉酶,糊精,丙,(2)下列关于上述固定化酶实验的叙述，错误的是()A固定化酶柱长度和淀粉溶液流速决定了酶柱中酶的含量B淀粉溶液流速过快会导致流出液中含有淀粉C各组实验所用的淀粉溶液浓度应相同D淀粉溶液的pH对实验结果有影响,(3)现有一份污水样品，某兴趣小组欲检测其中的细菌数，进行以下实验。将一定量的污水样品进行浓度梯度稀释。取适量不同稀释度的稀释液，用_法分别接种于固体平面培养基上，经培养后进行计数。该实验应注意，接种前，从盛有_的容器中将玻璃刮刀取出，放在酒精灯火焰上灼烧，冷却后待用；分组时，需用_作为对照。,A,涂布分离,70%酒精,未接种的培养基,(1)图中用高锰酸钾溶液浸泡苹果的目的是_。黑曲霉提取液中含有的_可水解果胶，从而使果汁澄清。固定化柱填充的石英砂通过_方式将酶固定化，酶被固定后用蒸馏水洗涤固定化柱是为了除去_。(2)实验中，操作流程A和B的先后次序为_。在苹果汁澄清过程中，应关闭的流速调节阀是_。要测定从固定化柱流出的苹果汁中是否还有果胶，可取一定量的果汁与等量的_混合，如果出现_