Wnt 、β-Catenin通路促进替代活化型巨噬细胞的激活将加重肾纤维化.ppt

Wnt/-Catenin通路促进替代活化型巨噬细胞的激活将加重肾纤维化,CKD组织学特征为过度的细胞外基质沉积和慢性炎症。在CKD患者患病肾脏中，巨噬细胞从血液中渗透和原位增殖引起的持续性巨噬细胞积累与肾纤维化进展密切相关。巨噬细胞在局部微环境的刺激下，可以分化为经典活化型（M1）和替代活化型（M2）。在CKD中，累积的M2巨噬细胞通过产生过量的细胞外基质和分泌促纤维化生长因子促进肾纤维化。然而，巨噬细胞增殖，迁移和极化的机制以及它们对肾纤维化的作用仍有待确定。,Wnt信号传导被分为经典和非经典信号通路，取决于-catenin是否被激活。对于经典的Wnt信号通路，-catenin在激活后积累在细胞质中，然后转移到细胞核中，结合细胞因子并刺激参与组织纤维形成的靶基因的转录。Wnt/-catenin激活可以防止小鼠肾小管细胞死亡和AKI。然而，足细胞或肾小管细胞中Wnt/-catenin的异常激活可能加重蛋白尿，肾功能不全和肾纤维化。此外，-catenin可以调节髓系细胞的运动性和粘附性，这有助于皮肤损伤后间充质细胞的积累。因此，有人推测在肾纤维化中，Wnt/-catenin活化可能促进巨噬细胞迁移并促进其累积。最近据报道，-catenin相关信号在肺部髓系细胞中的激活导致肺泡巨噬细胞亚型的分化，其拮抗肺纤维化的消退。强制表达-catenin变体能够促进巨噬细胞分化。在这方面，Wnt/-catenin信号可能调节巨噬细胞的积累和活化并加重CKD中的肾纤维化。在本研究中，我们发现Wnt/-catenin激活可以促进巨噬细胞M2极化。小鼠中巨噬细胞-catenin的缺失能够改善单侧输尿管梗阻性肾病（UUO）的肾纤维化，并且肾脏中的巨噬细胞积聚和M2极化较少。,一、Wnt3a加重IL-4或TGF1刺激的巨噬细胞M2极化M2巨噬细胞持续的积累可能促进CKD中的肾纤维化。在所有典型的Wnt分子中，Wnt3a是广泛用于刺激正常Wnt信号传导的一种。我们用Wnt3a处理小鼠腹腔巨噬细胞细胞系（Raw264.7）和骨髓来源的巨噬细胞（BMM）30分钟，然后用IL-4或TGF1处理，诱导巨噬细胞M2极化。在Raw264.7细胞中1、单独的Wnt3a不能诱导巨噬细胞M2极化2、与单独使用IL-4的那些相比，Wnt3a加IL-4可以大大增加M2巨噬细胞相关蛋白的表达，如Arg-1，MR和chitinase3-like3/Ym1。3、单独的TGF1只能诱导Arg-1mRNA表达，而Wnt3a加TGF1可以显着刺激Arg-1，Fizz1和chitinase3-like3/Ym1mRNA的表达。类似地，在BMM中，与单独的IL-4或TGF1处理相比，Wnt3a加IL-4或TGF1可进一步增加Arg-1，MR，chitinase3-like3/Ym1和Fizz1mRNA的表达。因此，很明显Wnt3a可能加剧IL-4或TGF1诱导的巨噬细胞M2极化。,巨噬细胞的极化受到各种转录因子（如STAT，PPAR，KLF和C/EBPb）的严格控制。-catenin的过度表达上调STAT3的表达和肿瘤细胞的活化。STAT3在Y705位点磷酸化促使其二聚化，核易位和与DNA结合。我们用IL-4或TGF1处理的BMM，检测STAT3在Y705位点磷酸化，发现可诱导STAT3磷酸化，并且Wnt3a可以进一步增加STAT3磷酸化。Westernblot检测结果显示，Wnt3a可进一步增强BMMs中的STAT3核移位。此外，STAT3的免疫染色进一步证实了这一观察结果。为了探讨STAT3激活在Wnt3a加重巨噬细胞M2极化中的作用，我们用STAT3抑制剂Stattic处理BMMs。结果表明，Stattic可以很大程度上抑制STAT3磷酸化和IL-4或TGF1加Wnt3a诱导的巨噬细胞M2极化，表明STAT3激活促进巨噬细胞M2极化的关键作用。因此，可以得出结论，Wnt3a通过上调STAT3表达和活化来加剧IL-4-或TGF1诱导的巨噬细胞M2极化。,二、-catenin信号传导的阻断抑制IL-4或TGF1诱导的巨噬细胞M2极化我们检测了在Raw264.7或BMM细胞中用IL-4或TGF1刺激诱导的-catenin蛋白信号传导。Western印迹分析和免疫染色显示，在两种细胞类型中，IL-4或TGF1处理后30分钟，-catenin均发生核转位。在用IL-4或TGF1处理的巨噬细胞中，发现-catenin表达增加。然后我们检测了-catenin信号传导阻断后两种巨噬细胞的M2极化。Raw264.7细胞和BMMs用ICG-001（一种特异性抑制-catenin蛋白转录的小分子）处理。IL-4或TGF1可诱导Raw264.7和BMM巨噬细胞M2极化。ICG-001可以显著降低Raw264.7细胞中IL-4诱导的M2相关基因Arg-1，MR，chitinase3like3/Ym1和Fizz1mRNA表达，以及TGF1诱导的Arg-1和YM1mRNA表达。在BMM中，IL-4或TGF1刺激的巨噬细胞M2极化被ICG-001处理显着抑制。我们还从小鼠分离的BMM以诱导-catenin蛋白基因缺失，-catenin在BMM中的消除可以阻止IL-4或TGF1刺激的巨噬细胞M2极化。,为了探讨-catenin调节巨噬细胞M2极化的机制，我们检测了两种细胞类型中STAT3在Y705的磷酸化。ICG-001可以大大降低BMMs中IL-4或TGF1刺激的p-STAT3和STAT3上调。-catenin阴性BMMs中p-STAT3和STAT3的蛋白质丰度低于-catenin蛋白阳性的BMMs。免疫染色显示，ICG-001或-catenin蛋白缺失可能减少IL-4或TGF1诱导的STAT3核易位。因此，很明显，通过下调STAT3表达和活化来阻断-catenin蛋白信号传导可以抑制巨噬细胞M2极化。,三、UUO的纤维化肾脏中巨噬细胞的-Catenin激活为了研究-catenin信号是否在纤维化肾脏的巨噬细胞中被激活，我们在UUO小鼠的第1周和第2周，从小鼠骨髓，脾脏和纤维化肾脏分离巨噬细胞。Western印迹分析显示，在骨髓或脾脏巨噬细胞中检测到较少的p-catenin(Ser675),Snail,或者CyclinD1，而在来自纤维化肾脏的巨噬细胞中，-catenin蛋白，p-catenin蛋白（Ser675）和-catenin信号靶基因（包括PAI-1和Snail）有很大程度上升高。此外，共同免疫染色结果显示，在假手术组肾脏中，检测到少量具有少量-catenin蛋白的F4/80（成熟小鼠巨噬细胞标志物）阳性巨噬细胞，而在UUO肾中，-catenin在F4/80阳性巨噬细胞中发生核易位。我们还从骨髓，脾脏和UUO肾脏中的巨噬细胞中提取核蛋白。Westernblot检测显示，UUO肾巨噬细胞核中检测到-catenin，但在骨髓和脾脏中未检测到-catenin蛋白。总之，这些数据表明，-catenin信号传导在来自UUO肾的巨噬细胞激活。,四、巨噬细胞中消除-Catenin将改善小鼠UUO肾病为了探讨巨噬细胞-catenin信号传导在肾纤维化中的作用，我们培养了一种具有诱导型巨噬细胞-catenin蛋白缺失的小鼠模型。并命名为Mac-catenin-/-。免疫染色和Western印迹分析显示Mac-catenin-/-小鼠巨噬细胞中-catenin的缺失。对照组Mac-catenin+/+和敲除组Mac-catenin-/-均接受UUO。然后，我们检查了UUO后Mac-catenin+/+和Mac-catenin-/-小鼠的肾脏组织学变化。在Mac-catenin+/+小鼠中，在UUO后检测到显著的肾小管萎缩，间质细胞外基质沉积，FN（大鼠纤维连接蛋白）和a-SMA（平滑肌动蛋白）表达增加，而在敲除肾脏中，肾小管损伤和间质纤维化明显减弱。在UUO后，来自Mac-catenin蛋白+/+同窝出生物的肾脏中的FN，a-SMA和I型胶原蛋白丰度显着增加，而在敲除中它们大大降低。因此，这些结果表明，巨噬细胞中-catenin的缺失减少UUO肾脏中的肾纤维化,五、巨噬细胞中-Catenin的消除减少UUO肾中的巨噬细胞M2极化手术前，Mac-catenin蛋白+/+和Mac-catenin蛋白-/-小鼠之间无差异，检测到少量F4/80阳性巨噬细胞。UUO后第7天和第14天，在Mac-catenin+/+肾脏中巨噬细胞积累量大大增加，而在敲除肾脏中，巨噬细胞积累较少。然后我们用针对F4/80的抗体对肾组织进行成像，并检测cleavedcaspase3以鉴定巨噬细胞凋亡。在假手术组中F4/80染色阳性细胞检测到具有cleavedcaspase3阳性的很少。在UUO后的第14天，在Mac-catenin蛋白+/+小鼠肾中约1.5的巨噬细胞cleavedcaspase3阳性，与Mac-catenin蛋白-/-肾中的那些相当。总之，这些数据表明，巨噬细胞中-catenin的消融可能不影响UUO肾中的巨噬细胞凋亡。,在UUO肾脏中，Mac-catenin+/+小鼠中F4/80和MR染色阳性细胞数量增加，这在Mac-catenin蛋白-/-中少得多。CD11b和CD206的流式细胞术分析证实了免疫染色的结果。蛋白质印迹分析显示，UUO后，从Mac-catenin-/-肾富集的巨噬细胞的MR丰度与Mac-catenin+/+小鼠相比少得多。类似地在UUO之后，来自Mac-catenin蛋白+/+肾的巨噬细胞中的Arg-1，MR，chitinase3-like3/Ym1和Fizz1mRNA表达显著增加，这在Mac-catenin蛋白+/+肾的巨噬细胞中少得多。此外，在UUO之后，来自Mac-catenin蛋白+/+肾的巨噬细胞中促纤维化细胞因子mRNA丰度，包括PDGFA，PDGFB，PDGFC，PDGFD，VEGFC，TGF1，TGF2，TGF3和CTGF被大量上调，来自Mac-catenin蛋白-/-肾的丰度小得多。有趣的是，UUO后，来自Mac-catenin+/+肾的巨噬细胞，M1型巨噬细胞标志物mRNA的丰度显著增加，包括iNOS，IL-6，IL-1b和TNFa的，并且在Mac-catenin-/-的肾脏巨噬细胞中的丰度高得多。总的来说，这些数据显示，在UUO肾病的纤维化肾脏中，巨噬细胞中-catenin的消除减少巨噬细胞M2极化。,IL-4或TGF1可加剧巨噬细胞M2极化，这一过程涉及STAT3激活的。在UUO肾中消除巨噬细胞中-catenin可减少巨噬细胞M2极化和肾纤维化。本研究确定了促进CKD肾纤维化的Wnt/-catenin蛋白信号传导的新机制。,Wnt/-catenin蛋白信号在成年肾脏中相对沉默，并在实验动物模型和CKD病人中重新激活。证据表明，Wnt/-catenin蛋白信号传导与肾损伤和修复有关。适当活化可防止肾小管细胞死亡和AKI，持续活化可导致进行性肾纤维化。巨噬细胞在肾纤维化部位积聚具。-联蛋白调节细胞运动性和粘附性，它的激活对于巨噬细胞的聚集至关重要。单核细胞/巨噬细胞在受伤的肾脏进行募集之后分化成不同的亚型。M1巨噬细胞产生大量的促炎介质;相比之下，M2巨噬细胞表现出抗炎特征，并参与肾脏修复和纤维化。在本研究中，巨噬细胞中-catenin的消除促进了纤维化肾中的巨噬细胞M1极化。然而，-catenin蛋白缺失增强的巨噬细胞在肾纤维化中的M1极化潜在的机制仍有待确定。相反，catenin蛋白的消除减少了巨噬细胞M2极化和促纤维细胞因子的表达。在培养的巨噬细胞中，Wnt3a处理可能加剧IL-4或TGF1诱导的巨噬细胞M2极化。-catenin信号传导阻断可抑制巨噬细胞M2极化。关于聚集的M2巨噬细胞在CKD中的促纤维化作用，可以得出结论，-catenin素介导的巨噬细胞M2极化有助于肾纤维化。,巨噬细胞极化被转录因子（如STAT3，PPARs，KLF和C/EBPb）的激活所严格控制。-catenin蛋白的过度表达可能增加STAT3的表达。在本研究中，单独的Wnt3a可上调STAT3表达，它可以协同IL-4T或GF1诱导的STAT3磷酸化。阻断catenin蛋白信号传导可抑制IL-4或TGF1诱导的STAT3磷酸化。此外，用Stattic阻断STAT3可以大大抑制巨噬细胞M2极化。将所有数据放在一起，可以得出结论，Wnt/-