GBT 28073-2011 南芥菜花叶病毒检疫鉴定方法

502001B 16  28073 1南芥菜花叶病毒检疫鉴定方法of 1230发布 2012。刖置 28073009给出的规则起草。本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国厦门出入境检验检疫局、中华人民共和国上海出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国福建出入境检验检疫局。本标准主要起草人：廖富荣、于翠、张永江、陈红运、林石明、陈青、黄蓬英、沈建国、吴嫒。1范围南芥菜花叶病毒检疫鉴定方法28073本标准规定了南芥菜花叶病毒血清学和分子生物学的检测鉴定方法。本标准适用于植物种子、鳞球茎、苗木和组培苗等植物及其产品中南芥菜花叶病毒的检测与鉴定。2南芥菜花叶病毒基本信息中文名：南芥菜花叶病毒。英文名：名：酒花荨麻病病毒)；黄花叶病毒)；钩子黄矮病毒)；腊树环线状病毒)；黄花叶病毒)；翘黄网状病毒)；莉黄斑病毒)。英文缩写：豇豆花叶病毒科虫传多面体病毒属芥菜花叶病毒的其他信息参见附录A。3方法原理利用基于抗原抗体反应的双抗夹心酶联免疫吸附测定(反转录和体外的反转录聚合酶链式反应(行检测鉴定。4主要仪器设备本标准的检测鉴定方法主要使用以下仪器设备：微量榨汁机、酶标仪、洗板机、微量天平(感量：0001g)、光泳仪、水平电泳槽、凝胶成像仪、高速冷冻台式离心机、水浴槽、00000000pL、 5检测与鉴定51g101：10比例加入样品提取缓冲液，转移到5000r清液作为置阴性对照、阳性对照和空白对照，阴性对照的种类和材料(如：种子或叶片)应该尽量与所检测样品类型相一致。具体操作过程见附录B。注：提取液在3则保存在4中。】28073 后用健康的植物组织作阴性对照，用感染 超纯水作空白对照。具体操作过程见附录c。53实时荧光转录合成健康的植物组织作阴性对照，用感染超纯水作空白对照。具体操作过程见附录D。54序列测定将行克隆、测序，或者直接测序，测序可由生物公司完成。把测序所得到的核苷酸序列与已知的果翻译后氨基酸序列与已知的判定为于75则判定为非：序列比对可利用址为结果判定与报告61结果判定当产生以下检测结果时，则判定为检出当时荧光中有两种方法检测结果呈阳性时，判定为检出当定的序列为判定为检出2结果记录与保存记录各项实验数据，包括样品种类、来源，检测时间、地点、方法和结果等。血清学检测结果保存吸光值的数据报告，时荧光列测定结果保存测序报告图。A1分布附录A(资料性附录) 南芥菜花叶病毒简介280732011 欧洲：奥地利、白俄罗斯、比利时、保加利亚、塞浦路斯、捷克共和国、丹麦、芬兰、法国、德国、匈牙利、爱尔兰、意大利、拉脱维亚、立陶宛、卢森堡公国、摩尔多瓦、荷兰、挪威、波兰、罗马尼亚、俄罗斯、斯洛伐克、斯洛文尼亚、瑞典、瑞士、英国、乌克兰和南斯拉夫。亚洲：日本、哈萨克斯坦、土耳其、伊朗。非洲：南非。北美洲：加拿大、美国。大洋洲：澳大利亚、新西兰。A2形态特征该病毒属线虫传多面体病毒，病毒粒体为等轴对称二十面体，直径约30双分体病毒，含有两条相对分子质量分别为24106的单链速离心后分为T(53S)，M(93S)和B(126S)三个组分。该病毒具有一个外壳蛋白，相对分子质量为543寄主范围及症状要为害的作物有大麻(啤酒花(黄瓜(西葫芦(莴苣(草莓(葡萄(香石竹(水仙(蔷薇(草木樨(郁金香(芹菜(薄荷(丁香(大豆(甜菜(马铃薯(烟草(番茄(菜豆(豇豆(蚕豆(豌豆(甜瓜(花椰菜(菠菜(胡萝h(。株矮化、严重畸型、耳突。症状随着寄主植物、病毒的分离物、栽培条件、季节和年份的不同而改变。有时候不会在寄主植物上表现症状。在鉴别寄主上产生的症状：a)昆诺藜(苋色藜(c种叶上形成褪绿的局部斑点，然后形成系统性斑驳；b)黄瓜(c接种的子叶上产生褪绿的局部斑点，以及系统性脉带或黄色斑点；c)菜豆(P产生坏死的局部枯斑、系统性坏死和畸型；d)矮牵牛(产生局部坏死斑点或小的坏死环和系统性环斑，以及线状斑或明脉。328073不是所有株系能够产生这些明显区别的症状，如啤酒花株系(不能产生这些明显的症状。另外，病毒混合侵染，从而产生更加复杂的症状。因此，使用鉴别寄主进行鉴定时，还需结合其他方法，如4传播途径 苗传播也很普遍，也可通过介体线虫传播。通过种子传播的寄主：莴苣(L松草莓(F大豆(G甜菜(B番茄(L。通过块茎传播的寄主：马铃薯(s。通过鳞球茎传播的寄主：水仙(N郁金香(百合(。通过苗木传播的寄主：葡萄(V草莓(F啤酒花(H1香石竹(D蔷薇(R。传播介体主要为异尾剑线虫(A5血清学特性纯的病毒免疫兔子后，可以制备出高质量的抗血清。番茄环斑病毒(血清之间无交叉反应，与健康寄主和常见的自然寄主蛋白也无反应。A6线虫传多面体病毒属区分种的标准线虫传多面体病毒属区分种的标准是：a)外壳蛋白(P)的氨基酸序列同源性小于75b)聚合蛋白酶的氨基酸序列同源性小于75；c)在可能的成分间没有假重组；d)抗原反应有差异；e)不同的介体种类。B11包被缓冲液()附录B(规范性附录) 280731碳酸钠(15993020，然后加水至1 L。B12磷酸盐缓冲液()氯化钠(02a：115202，然后加水至1 L。B13升14样品提取缓冲液()15酶标抗体稀释缓冲液2卵白蛋白。B16底物缓冲液二乙醇胺97氮化钠(02，然后加：缓冲液可以储存在410中至少2个月，使用前回温至室温。B2操作步骤B21包被根据检测试剂盒说明，用包被缓冲液稀释1：200)，在微孔板中每孔加入100止包5280731 被抗体溶液。在室温下孵育2h4包被过夜。B22捕获抗原倒去孔中的抗体包被溶液，用次(可在洗板机上完成)。个样品至少2个重复。并设置阳性和阴性对照。在室温下孵育2过夜。B23加入酶标抗体 根据试剂盒说明，用酶标抗体缓冲液稀释相应的酶标抗体(如1：200)。倒去孔中的检测样品提取液，用次孔(可在洗板机上完成)。每孔加入100止酶标抗体溶液。在室温下孵育2h。B24加底物用底物缓冲液把对硝基苯磷酸二钠盐(制1mg去酶标抗体溶液，用次或在洗板机上完成。每孔加入100温下避光放置300阳性对照孔明显显色。B25吸光值的测定用酶标仪在4053结果判定通过酶标仪上405照孔的(缓冲液孔、阴性对照及阳性对照孔)应该在质量控制范围内，即：缓冲液孔和阴性对照孔的2，判为阳性；样品阴性对照，判为阴性；样品阴性对照。值在阈值附近，判为可疑样品，需重新做一次，或用其他方法加以验证。c1主要试剂附录C(规范性附录)280731 氯甲烷、异丙醇、70乙醇。C12反转录试剂00U1L)、5反应缓冲液(250"25、375 5 010 )、0UC1315的、10)。 C2引物序列，位于计扩增产物大小为370物可由有关生物公司合成和纯化。表c1物名称引物序列在112011394681489注：也可以采用在3总5go1入1温放置5上清液到另一离心管中；加入三氯甲烷200分振荡15s，室温放置3g，4离心15上层水相加入另一离心管中，加入05 2000g，4，离心10去上清液；加入醇洗涤；经过焦碳酸二乙酯(理的超纯水40：本方法是根据保证总可以采用其他总B40)，于95的水浴中7后迅速冰浴5续加入5pL、0)0500U5弘L、弘L、经后37水浴1h，95水浴10然冷却至室温，箱中保存。C5行5 1020 的255U5pL、种各含10)050)1001)10pL、pL、反应条件：94预变性3后94变性30s、56退火30s、72延伸1行35个循环，最后一个循环结束后72继续延伸76琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳分析。每个样品取5样缓冲液混合均匀，并加到置于05琼脂糖凝胶孔中，然后在120 泳结束后，放人装有05pgB)溶液的容器中染色，然后在清水中清洗后，在凝胶成像系统中观察，拍照，并保存照片。c7结果判定在阴性对照没有产生条带、阳性对照产生约370果检测样品出现与阳性对照大小一致的条带，则判定为阳性；否则判定为阴性。D1引物及探针序列附录D(规范性附录)实时荧光28073增区域在增长度100中针5一端标记报告荧光染料63。端标记淬灭荧光染料洼：探针也可以用其他荧光染料标记。表D1实时荧光的位置2458121(3，71在总。D3实时荧光，然后进行实时荧光2525_0弘0)，100)，0