放射性配体与受体结合分析实验(RBA)方法

。放射配体和受体结合分析实验方法，刘兴华，2011年5月13日，药理学讲座，内容、实验定义和原理实验材料和仪器实验方法斯卡查德方程和映射(饱和和竞争实验)RBA安全实验示例、实验定义和原理放射性配体-受体结合分析的定义简称受体放射分析。使用放射性核素标记的配体结合特定受体、研究受体的亲和力和数量以及研究受体亚型是一种常见的方法。原理放射性标记的配体(激动剂或拮抗剂)与含有受体的组织、细胞或制剂一起孵育，使受体与配体完全结合，形成受体-配体复合物。反应终止后，通过过滤或离心去除未结合的标记，测量滤膜或沉淀物中的放射性，以计算结合到配体上的受体的量。嘿。RBA分类，RBA使用放射性核素标记配体，并与相应的受体进行特异性结合反应，可以对受体的性质进行定性和定量分析。1.定性RBA:通过改变反应的量效关系来判断受体类型、单位点或多位点结合类型、受体与配体的结合特征、反应的可逆性和协同性。2.定量RBA:基于已知的配体和受体的反应性质，通过结合反应，给出了在一定数量的组织或细胞中能与放射性配体结合的受体数量和平衡解离常数或结合位点数量(最大结合能力)。实验材料和仪器、实验材料、动物组织(皮质、海马、纹状体等。)仪器(组织匀浆器、涡流混合器、低温高速离心机、电热恒温水箱、80冰箱、制冰机、过滤瓶、液体闪烁仪等。)材料(2ml/6ml分离管、10ul/200ul/1ml枪头、超细纤维滤纸等。)药物(放射性配体、各种非标准计量化合物等。)，实验仪器，组织均化器IKA，T10BS25涡流混合器WH-2，低温高速离心机科达、TGL20M超低温冰箱海尔、数字显示恒温水浴锅严敬，HH-S26S制冰机格林型号IMS-50自动雪花，电热恒温水箱，循环水型多用途真空泵液体闪蒸测定计数器HIDEX，425-034，实验材料，2ml离心管，6ml一次性软试管。枪头，1毫升，10微升，200微升。TrisPPO和POPOP，2、加入样品，孵育结合反应；(3)终止反应，从游离物质(4)中分离共轭物，并测量共轭物的放射性；5.数据处理。实验具体操作(D2 D1，5-HT)，1。制备各种缓冲液和试剂按处方比例制备各种缓冲液储备液制备各种未标记的配体溶液制备各种待测药物溶液注：本操作所需的试剂或仪器：分析天平、移液枪、烧杯、量筒、容量瓶、试管、极压管及其他试剂：无水乙醇、超纯水、Tris、抗血酸、余江宁、盐酸、氯化钠、KCl、氯化镁、二甲基亚砜、甲苯、PPO、POPOP、甲基叔丁基醚、丁羟醇、5HT等。2.膜受体的制备。将大鼠脑断头，分离目标组织，加入10倍体积的冰冷缓冲液，用组织匀浆器匀浆3次，每次数秒。将制备的组织匀浆器用低温超级离心机(12000 rpm)离心3次，每次弃去上清液20分钟。沉淀(膜受体)储存在-80度超低温冰箱中备用：手术所需的试剂或仪器：手术仪器、组织匀浆器、制冰机、超低温冰箱、低温超高离心试剂：超纯水。3.加入样品，取出膜受体，加入一定体积的冰冷缓冲液，混合均匀，形成一定浓度的膜受体溶液。取放射性配体母液，用无水乙醇稀释至所需浓度，按以下顺序和比例加入各种反应溶液。(1)总结合管：100微升膜受体200微升缓冲液10微升放射性配体(2)非特异性管：100微升膜受体100微升缓冲液100微升未标记配体10微升放射性配体(3)试管：100微升膜受体100微升缓冲液100微升药物溶液10微升放射性配体注：该操作所需的试剂或仪器：移液管、烧杯、试剂如量筒和极压管：超纯水、无水乙醇、放射性配体母液。4、受体配体结合反应。将放射性配体加入上述试管后，立即将它们放入37度水浴中孵育20分钟。20分钟后，将每个试管放入冰中以终止反应。注：本操作所需的试剂或仪器：恒温水浴，制冰机试剂：无。5.分离游离和结合的放射性配体。反应完成后，将上述试管分别倒入抽滤装置中进行过滤，用5-10毫升冷缓冲液冲洗滤膜两次。将滤膜置于85度烘箱中干燥，然后置于试管中，加入一定体积的闪烁液浸泡过夜。注：本操作所需的试剂或仪器有：吸滤器、烘箱、滤纸、移液枪、液体闪烁杯试剂：甲苯、PPO、POPOP、6。测定结合放射性配体每分钟的辐射计数，并使用放射性计数器测定每个试管中结合放射性配体每分钟的辐射计数。注意：该操作所需的试剂或仪器有：液体闪烁仪试剂：无。7。数据处理。根据下面的公式，计算每种化合物对同位素配体结合的抑制率的百分比：抑制率(I%)=(总结合管CPM-化合物cpm)/(总结合管CPM-非特异性结合管cpm)100%化合物在每个实验中经受两个双管和两个独立的实验。8，各种指标，IC50:半抑制浓度KD:平衡解离常数(mol/L)，物理意义是当受体具有半结合配体时所需的配体浓度。最大值：受体的最大结合能力(fmol/毫克蛋白)NH:希尔系数，斯卡查德方程和映射(饱和实验)。斯卡查德方程和映射，简单单位点系统受体和配体结合反应(克拉克模型)条件：(1)配体和受体结合反应是可逆的双分子反应；(2)所有受体都是等价和独立的。同一受体的不同分子对配体具有相同的亲和力，并且不受相邻受体分子是否与配体结合的影响。(3)配体本身没有代谢或结合到其他位点；(4)生物效应的强度和浓度与总配体浓度相似。饱和曲线，受体的固定数量，非标准的固定数量和不同浓度体积的放射性配体，饱和曲线，1)饱和曲线受体的数量是恒定的，当配体的浓度(一般不同浓度体积的放射性配体和非标准的固定数量)从零上升时，形成的络合物逐渐增加。然而，由于受体数量有限和可逆反应，R1(受体配体复合物)的增加不是直线上升，而是先快速上升后缓慢上升的曲线。最后，当大多数受体与配体结合时，R1的增加非常缓慢且逐渐水平，即受体是饱和的，这是饱和曲线。#饱和曲线的作用？Scatchard映射，KD和Bmax。2)曲线高度取决于RT。在曲线的开始，曲线的上升速度，即曲线的斜率取决于配体和受体的亲和力。因此，KD越小(亲和力越大)，饱和曲线上升越快，KD越大(亲和力越小)，饱和曲线上升越慢。(即，亲和力越大，受体与附件结合得越快，时间越短)k1，v1rl-R1k2，v2KD=k2/k1=rl)/R1，饱和度曲线的形状与kd相关(图1)。图1KD对饱和度曲线的影响，饱和曲线的高度取决于RT(图2)。图2RT对饱和度曲线的影响，Massactionlaw:受体与配体的结合反应服从可逆反应的质量作用定律，可由下式表示：k1，v1 R L-RL (1) k2，v2在上式中，R和L是游离受体和游离配体的浓度，RL是络合物的浓度。V1和v2是结合率和解离率，k1和k2是根据质量作用定律：V1=K1rl；V2=k2R1当反应达到平衡时，v1=v2，即： k1RL=k2R1，平衡离解常数(KD)的数学表达式为：KD=k2/k1=RL/R1(2)。斯卡查德图，其中LT为配体的初始浓度，RT为受体的初始浓度(即受体的总量)。然后有：L=ltRLr=rtRL由式(2)获得：KD=rt-rl l rl由上述式获得：rl=rt-1 _ rl(斯卡查德方程)LKD变形：RL是受体和配体之间的特异性结合的量，由B代替，并且L是游离配体的量，由F代替。RT是受体的总量，即受体的最大结合量，由Bmax表示，然后上述方程变为B/F=Bmax/KD-B/KD(RT是受体的总量，等于R和RL之和，也是最大结合量Bmax)，绘制在配合物浓度RL的横坐标上，以及配合物浓度和游离配体的浓度比RL/L的纵坐标上，即斯卡查德图。图3显示了简单单位点系统RBA的Scatchard图。简单单位点系统的斯卡查德图是一条斜率为-(1/KD)的直线，水平轴截距为RT，垂直轴截距为RT/KD(见图3)。KD和Bmax。得到了希尔方程和曲线图。当一个受体分子能结合一个以上的配体时，配体受体结合反应不是简单的双分子反应，而是k1，v1 r n L-n rl。Hill方程：k2，v2根据质量作用定律导出并变形，其中n是Hill系数，结合分数B/Bmax相对于游离配体l作图以获得Hill图(右)。(3)、(2)、(3)、(3)取式(3)两边的对数，非特异性结合(NSB)，非特异性结合在RBA系统中，放射性配体可以与其他组分(如非特异性蛋白、反应容器、分离材料等)结合。)除了与受体特异性结合。NSB具有亲和力小、结合容量大、不易饱和的特点。它随着反应体系中配体浓度的增加而线性增加，这种结合与生物效应无关(见图4)。在图4的饱和曲线实验中，TB、SB和NSB之间的关系。在RBA的数据处理过程中，必须从NSB中减去测得的总结合活性，以获得特异性结合数据。竞争曲线、固定的放射性配体浓度、一定量的受体和不同浓度的未标记化合物。数学表达式，本实验用于确定非标准药物与放射性配体竞争结合同一受体的能力。IC50和Ki通常用于表示。闪烁液体，包括溶剂、闪烁剂和添加剂溶剂：溶解闪烁剂和放射性样品，吸收和转移辐射能量。闪烁体：第一个闪烁体(吸收激发的溶剂能量并去激发光)，第二个闪烁体(波长转换，匹配光电倍增管光谱；添加剂：助溶剂、抗猝灭剂、每个受体的非标准同位素，RBA安全问题，射线，放射性物质发出的辐射有三种：自然辐射现象、三种辐射，射线，射线，射线，射线，它可以根据辐射的偏转方向和磁场方向之间的关系来确定，而偏转较小的光束由带正电的粒子组成，我们称之为射线。阿尔法射线由带正电荷的阿尔法粒子组成。科学家发现每个粒子的正电荷是电子的两倍，粒子的质量大约等于氦原子的质量。进一步的研究表明，阿尔法粒子是氦核。因为阿尔法粒子的质量较大，所以阿尔法射线的穿透力很小。我们可以用一张厚纸把它堵住。射线，即与射线偏转方向相反的光束，带负电荷。我们称之为射线。研究发现射线由带负电的粒子(粒子)组成。进一步的研究表明，粒子是电子。射线有很强的穿透力，能轻易穿透黑纸，也能穿透几厘米厚的铝板。嘿。嘿。不在中间偏转的射线叫做射线。研究表明，射线的本质是一种波长极短的电磁波，它是不带电荷的中性电磁波。射线具有很强的穿透力。一般来说，薄金属板无法抵抗。它能穿透几十厘米厚的水泥墙和几百厘米厚的铅板。射线。在某个核反应中，中子变成了电子和质子。这就是为什么原子核里没有电子，而电子被发射出来。这就是射线产生的原因。射线是带负电的粒子，高速运行，从核素的放射性衰变中释放出来。人类暴露在来自人造或天然来源的射线下(氚、碳-14等)。)。射线比射线穿透力更强，但在相同距离下造成的伤害更小。一些射线可以穿透皮肤，造成放射性损伤。但是一旦它进入身体，就会造成更多的伤害。粒子可以被身体外部的衣服切断或阻挡，或者被几毫米厚的铝箔完全阻挡。辐射防护措施、外部辐射防护措施和时间保护：尽量减少暴露时间。距离保护：距离越远，辐射能量越低。屏蔽保护：注意防止阿尔法射线的内部照射；射线可用于原子序数较低的物质，如铝、有机玻璃和塑料。伽马射线可以由高原子序数物质制成，如铅、铁和混凝土。内部辐射防护措施、封闭、隔离和防扩散：“三区配置”方法，即清洁区、中间区和活动区；通风良好且独立的污水处理系统；遵循标准操作程序。清除污垢、清洁、防止污染和防止入侵的个人防护：穿适当的个人防护服，如工作服、口罩、鞋、帽等。在工作场所不要吃东西或抽烟。工作完成后，应进行卫生清洁和污染检测。放射性“三废”处理，基本方法：放置和衰变，浓缩和储存，稀释和排放固体：一般采用放置法(短半衰期)，焚烧法(废气处理)，掩埋法(不可燃/焚烧残渣)液体：一般采用放置法(短半衰期)，稀释法(少量和低浓度)，浓缩法(浓缩和掩埋)气体：大气排放(低浓度/气溶胶)，过滤或液体吸收(高浓度)，表面放射性污染处理，皮肤：温和，大量清水和肥皂清洗；严重时，用10%或6.5%高锰酸钾浸泡清洗工作场所表面：温和、大量清水或洗涤剂清洗；严重，移除，重新填充或覆盖油漆/塑料板工作服：温和，肥皂水；严重的，0.02毫升/升盐酸，1%草酸清洗或废物处理仪器设备：玻璃和陶瓷，3%盐酸/10%柠檬酸浸泡1小时，清洗，用洗液清洗15分钟，然后清洗；金属，用肥皂、柠檬酸钠、乙二胺四乙酸或其他有机溶剂或超声波清洗，将2.5g生理盐水甲苯闪烁PPO 2，5-二苯基噁唑2，5-二甲基噁唑和0.05g波波普1，4-双(5-苯基噁唑-2-