锌指蛋白核酸酶的作用原理及其应用

HEREDITAS (Beijing) 2011 年 2 月, 33(2): 123130 ISSN 0253-9772 综 述 收稿日期: 201007; 修回日期: 20101107 基金项目: 国家转基因重大专项与教育部创新团队项目(编号：IRT0831)资助 作者简介: 钟强, 博士, 研究方向：生物信息学。E-mail: zqiang320 通讯作者: 赵书红, 教授, 博士, 研究方向：动物分子生物学与育种。E-mail: shzhao DOI: 10.3724/SP.J.1005.2011.00123 锌指蛋白核酸酶的作用原理及其应用 钟强, 赵书红 华中农业大学农业动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室, 农业部猪遗传育种重点开放实验室, 武汉 430070 摘要: 锌指蛋白核酸酶(Zinc finger nucleases, ZFN)因其能特异性识别并切割 DNA 序列以及可设计性, 被 用于基因定点突变和外源基因定点整合。目前, ZFN 技术以其准确的靶位点设计能力和诱发高效率基因打靶的 优势, 越来越受到基因改造研究者的重视, 已经成功应用于动植物细胞、胚胎的基因改造。随着鉴定靶 DNA 高亲和力的锌指蛋白(Zinc finger protein, ZFP)实验技术日渐成熟, 可以预见到不久的将来这项技术会在基因工 程和育种中得到广泛应用。文章介绍了锌指蛋白识别 DNA 靶位点和 ZFN 介导的基因打靶(Double strand break gene targeting, DSB-GT)的原理, 同时还综述了目前 ZFN 技术用于基因改造的研究进展。 关键词: 锌指结构域; 锌指蛋白; 锌指蛋白核酸酶; 同源重组; 基因打靶 The mechanism and application of zinc finger nucleases ZHONG Qiang , ZHAO Shu-Hong Key Laboratory of Agricultural Animal Genetics, Breeding and Reproduction of Ministry of Education of China, College of Animal Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China Abstract: Due to specific recognization of DNA sequences and designability, zinc finger nucleases (ZFN) has been used in knock in and knock out genes. Because of high ratio of homologous recombination of DSB-GT induces by ZFN, ZFN technology has been considered as the most powerful tool for gene modification. It has been successfully used at cell or embryo levels in plants and animals. Under the rapid development of high affinity zinc finger protein (ZFP), this technique will be applied to genetic engineering and breeding extensively in the future. This review discussed the DNA recognization mechanism and double strand break gene targeting (DSB-GT) of zinc finger nucleases (ZFN). Some application examples of ZFN were summarized. Keywords: zinc finger domain; zinc finger protein; zinc finger nucleases; homologous recombination; gene targeting 锌指蛋白核酸酶是人工改造的蛋白, 它利用了 锌指结构域对 DNA 序列的特异性识别来达到准确 定位靶点的目的, 同时利用核酸酶的 DNA水解活性, 使靶 DNA 双链断裂, 然后利用细胞的修复机制, 引 入基因突变13。该项技术已经被成功用于动植物基 因改造实验中, 研究者根据靶 DNA序列设计特异性 的锌指蛋白, 然后用锌指蛋白核酸酶(Zinc finger nucleases, ZFN)定点突变 DNA, 并引入外源基因, 该技术具有非常高的基因整合效率48。 在整个实验 流程中, 设计特异性的锌指蛋白(Zinc finger protein, ZFP)是最关键的环节, 应用大肠杆菌双杂交报告系 统(Bacterial cell based two-hybrid (B2H) reporter sys- tem)筛选高亲和力的ZFP是目前最为流行的方法9, 10。 这些高亲和力的 ZFP 被提交到公共的数据库中, 以 124 HEREDITAS (Beijing) 2011 第 33 卷 便研究者在此基础上设计新的 ZFP11。由于高亲和 力并不等于高特异性12, 因此为了减小 ZFP 的脱靶 率, 降低 ZFN 造成的细胞毒性和基因毒性, 迫切需 要设计出高特异性的 ZFP13。目前已经有研究者采 用计算生物学方法设计高特异性的 ZFP1416, 随着 越来越多的研究和生产需要, 类似的方法还会不断 出现。作为遗传研究工作者有必要深入的了解 ZFN 技术的原理和发展趋势, 以便于及时掌握和改进该 项技术, 从而为研究和生产服务。本文综述了锌指蛋 白对 DNA 序列的特异性识别和 ZFN 的工作原理, 同时还对部分 ZFN 应用实例进行了概述。 1 锌指结构域对 DNA 序列的特异性识别 锌指结构域是转录因子用于识别靶 DNA 的蛋 白结构域, 因为这种蛋白结构域络合了一个锌离子, 所以称之为锌指结构域(Zinc finger)。Miller 等17最 早发现并阐述了锌指结构域的功能, 他们发现全长 为 344 个氨基酸的转录因子(Transcription Factor IIIA, TFIIIA)序列中, 13276 位氨基酸含有 9 个锌指 结构域, 锌指结构域由 30 个氨基酸组成, 每个锌指 结构域中 8 和 13 位的半胱氨酸以及 26 和 30 位的组 氨酸非常保守, 他们可以络合锌离子。因此这种类 型的锌指结构域被称为 C2H2, 另外还有 4 个位点都 是半胱氨酸的锌指结构域, 被称为 Cys4。 C2H2 型的 锌指结构广泛存在于转录因子中, 人的基因中有3% 的基因编码含有 C2H2 型的锌指结构域的蛋白18。 Miller等17推测识别DNA序列的氨基酸是锌指结构 域中 1425 位的氨基酸, 但没有确切的实验证据, 直到 Pavletich 等19测定了 ZIF268 与 DNA 绑定的晶 体结构, 锌指结构对 DNA的识别机制才有了比较清 晰的认识。 如图 1A 所示, 锌指结构域的 -螺旋嵌入 到 DNA 分子的大沟中, 螺旋上的 ARG46、 HIS49 和 THR52 侧链与大沟中的 3 到 5 方向的 DNA 链相互 识别, 这 3 个氨基酸位于 -螺旋的-1、3、6 位氨基 酸, 因此Pavletich等19提出的识别模式被称为-1、 3、 6 模式, 可以识别位于 DNA 上同一条链上 3 到 5 方向连续的 3 个碱基。这个识别模式被实验证实部 分正确20。随后 Fairall 等21测得了 ZIF268 与 DNA 绑定的晶体结构, 锌指结构域的 -螺旋上的1、2、 3、 6 位氨基酸可以与 DNA 形成氢键, 其中 2 位的氨 基酸识别 5 到 3 方向 DNA 链上的一个碱基, 如图 1B 所示, -螺旋上的 ARG152、ASP154、ASN155 和 ALA158 氨基酸侧链与 DNA 形成氢键, 可以识别 4 个碱基, 因此锌指结构域识别 DNA 碱基的模式调 整为-1、2、3、6 模式22, 这个模式通过 DNA 碱基 替换实验得到证实20, 22。 根据以上的分析, 发现每个锌指结构域可以识 别 3 到 5 方向 DNA 链的 3 个碱基以及 5 到 3 方向 的一个碱基。 是否可以根据这一规律设计与 DNA 序 列特异结合的锌指结构呢？答案是肯定的, Isaland 等23使用噬菌体展示技术(Phage display)鉴定了与 靶 DNA序列具有较高亲和力的锌指结构, 该实验表 明根据已知的 DNA 序列可以找到与之结合的锌指结 构。由于一个锌指结构域只能识别 3 bp (Base pair), 图 1 锌指结构域识别靶 DNA 序列的三维结构 绿色表示锌指结构域, 橘红色表示 DNA。C2H2 结构与锌离子络合在一起(灰色小球)。红色小球表示水分子。A 图三维结构来源于(PDB ID:1ZAA), 锌指结构域识别 DNA 碱基的氨基酸为 ARG46、HIS49 和 THR52。ARG46、HIS49 和 THR52 识别链的方向为 3到 5端。B 图三维 结构来源于(PDB ID: 2DRP), 锌指结构域识别 DNA 碱基的氨基酸为 ARG152、ASP154、ASN155 和 ALA158。ARG152、ASN155 和 ALA158 识别 DNA 链的方向为 3 到 5端。ASP154 识别 DNA 链的方向为 5 到 3端。 第2期 钟强等: 锌指蛋白核酸酶的作用原理及其应用 125 对于全基因组来说至少有 18 bp 才能确保靶位点的 特异性。 因此需要有 810 个锌指结构连在一起才能 实现长片段的识别。因为 Doyon 等4用 8 个锌指结 构域实现了 DNA 的特异识别, 而且没有脱靶现象, 因此可以认为 810 个锌指结构域就可以实现靶位 点的特异识别。随着 DNA 加长, 9 bp 并不对应 3 个 锌指结构域, 因此 Moore 等24的实验设计了两种策 略来确定锌指结构域: (1) 32F, 这种方法在靶序列 中, 每隔 6 个碱基跳过一个碱基, 两对锌指结构域 之间插入一个甘氨酸(GLY)。(2) 23F, 这种方法在 靶序列中, 每隔 9 个碱基跳过两个碱基, 两个三联 体锌指结构域之间插入甘氨酸-丝氨酸-甘氨酸 (GLY-SER-GLY)。 实验表明 23F 方法设计的锌指蛋 白对靶位点的突变非常敏感, 因此 23F方法设计的 锌指蛋白对靶序列的识别特异性更高。 2 提高 ZFN 识别靶 DNA 的特异性 人工合成的锌指结构域采用了通用的氨基酸序列 作为模板, 这个氨基酸序列框架被证明是高效的25。 如图 2 所示, 锌指结构域中有 7 个氨基酸用于识别 三联体碱基, 因此可以通过改变这些氨基酸来提高 锌指结构域识别靶 DNA 的特异性。 TGEK 序列用于 连接相邻的两个锌指结构域。 Linker -1123456 TGEKPYKCPECGKSFSXXXXXXXHQRTH 图 2 锌指结构域的氨基酸序列 X 位置为可变的氨基酸, 改变这些氨基酸可以识别不同的三联体碱 基, 其上部表示氨基酸在-螺旋上的位置。 TGEK 序列用于连接两个 锌指结构域。 目前的实验已经测定了一些识别三联体碱基的锌 指结构域氨基酸序列, 如表 1 所示, 这些氨基酸序列 被证实与靶序列有较高的亲和力。在设计锌指蛋白的 时候通常以表 1 中的氨基酸序列作为参考。目前使用 的 ZFN 的核酸酶结构域已经被突变改造了, 可以防止 同源的 ZFN 结合在一起, 造成非特异性切割26, 27。 表 1 三联体碱基对应的较高亲和力的锌指结构域氨基酸序列 5 T C A G 3 SPNGLII1 SKPNLKM1 T RPNHLAI1 C QQTGLNV1 QKTGLRV1 QKEHLAG1 QREHLNG1 A T RADALMV2 REDNLHT2 RMDHLAG1 RSDHLSL1 RNEHLVL1 RSDHLTT2 G TTGALTE2 TKNSLTE2 TSGNLTE2 SRRTCRA2 T SKKHLAE2 SKKALTE2 HTGHLLE2 C C RSDALRE2 RNDALTE2 RNDTLTE2 RADNLTE2 RSDKLTE2 RSDNLTE2 G HKNALQN2 THLDLIR2 TTGNLTV2 VSSNLNV2 HRTTLTN2 T DKKDLTR2 DSGNLRV2 ERSHLRE2 C A RRDELNV2 RTDTLRD2 RSDNLTQ2 RKDNLKN2 RSDHLTN2 RSDHLKT2 RSDHLTQ2 G TTSALTR2 TSGALTR2 TSGSLVR2 QSSALTR2 HSSSLVR2 LSQTLKR1 LRDSLKR1 LKHDLRR1 LRQTLAR1 VAHSLKR1 VQNSLTR1 GRQALDR1 TKQGLQR1 TGQILDR1 QRQALDR1 TSGELVR2 QSSDLTR2 QSSDLQR2 VSSTLIR2 VRHNLQR1 VRHNLTR1 VAHNLRR1 TKQHLAV1 TRQNLDT1 TKQRLVV1 ISSNLQR2 QSSNLAR2 TSGNLVR2 TSANLSR2 TNQKLEV1 TSQRLAV1 TSGHLVR2 WPSNLTR2 T G 126 HEREDITAS (Beijing) 2011 第 33 卷 (续表 1) 5 T C A G 3 QDSSLRR1 QASALSR1 QSGALTR2 QSGALAR2 QRASLTR2 QSSSLVR2 QSSSLIR2 QSSTLTR2 QSGTLHR1 QSTTLKR1 NNAQLTR1 NKTDLGR1 SQTQLVR1 QSGSLTR2 QSGDLTR2 QSGDLRR2 QRNNLGR1 QRPNLGR1 QHPNLTR1 QRNNLDR1 QGGNLVR1 QMSNLDR1 QSNNLTR1 QSGNLAR2 QSSNLVR2 QSSNLTK2 QSSNLTR2 QKGNLLR2 QKSNLIR2 QRSNLVR2 THAHLTR1 RQDRLDR1 QNSHLRR1 QSAHLKR1 QSPHLKR1 QNSHLRR1 QSGHLAR2 QSGHLQR2 QRAHLER2 QRAHLIR2 QVSHLTR2 QHSHLVR2 QSTHLTR2 A G RRDMLRR1 RMDVLTR1 RKTILTT1 RNFILQR1 RPDALSR1 RPDALPR1 RSDALTR2 RSDALSR2 RSDELVR2 VSSSLRR2 KNDTLAR1 RLDMLAR1 RSDTLAR1 RTDTLAR1 RRDTLER1 RRDDLTR1 RSDDLTR2 RSDDLQR2 RSDDLVR2 RSDELNR2 SASNLTR1 VHWNLKR1 RQSNLSR1 RQMNLDR1 RQDNLGR1 RRDNLNR1 RGDNLKR1 RGDNLGR1 RADNLGR1 RHDQLTR1 RVENLHR1 REDNLGR1 RVDNLPR1 RDDNLQR1 KHHNLLR1 KKTNLTR1 RSDNLAR2 RSDNLTR2 RSDNLVR2 RKSNLIR2 KSSNLRR2 QSFNLRR2 SGSNFTR2 RGEHLTN1 RGDKLGH1 RSAHLQA1 RMEHLPR1 RIDKLGG1 RQEHLVR1 RREHLVR1 KQDHLTK1 KKDHLHR1 RSDHLAR2 RSDHLTR2 RSDHLSR2 RSDKLVR2 RKDHLTR2 RSDKLNR2 RRSHLTR2 G 注: 上标为 1 的数据来自于文献9, 上标为 2 的数据来自于文献10。 3 ZFN 的工作原理 针对靶序列设计 810 个锌指结构域, 将这些锌 指结构域连在 DNA核酸酶上, 便可实现靶序列的双 链断裂(Double strand break, DSB)。Kim 等28使用该 策略设计出了第一个锌指蛋白核酸酶, 该酶使用 3 个锌指结构域连接一个 Fok I 核酸酶的催化活性功 能域。结果表明人工合成的 ZFN 可以特异性的识别 和切割靶位点。ZFN 要切割靶位点必须以二聚体绑 定到靶位点上2932。 因此两个 ZFN 分别用锌指结构 域识别 5 到 3 方向和 3 到 5 方向的 DNA 链(图 3), 两个 Fok I 核酸酶的催化活性功能域可以切割靶位点。 当两个 ZFN 切割靶位点, 制造出双链断裂以后, 细胞的修复机制被激活, DNA 的同源重组机制会将 外源的同源片段复制到断裂缺口上, 从而达到引入 外源基因片段的目的33。ZFN 制造出双链断裂, DNA 图 3 四锌指结构域的 ZFN 二聚体识别并切割靶位点 绿色表示 ZFN-L, 从左面看它切割 3 到 5 方向的链; 青绿色表示 ZFN-R, 从左面看它切割 5 到 3 方向的链。 锌指蛋白和 DNA(PDB ID: 2I13), Fok I 核酸酶催化功能域(PDB ID: 2FOK)。 同源重组修复引入外源片段的效率增加了几千倍(图 4)18。 此外也有通过非同源末端连接(Non-homologous 第2期 钟强等: 锌指蛋白核酸酶的作用原理及其应用 127 end-joining, NHEJ)引入外源基因片段的报道, 该方 法所需的外源基因片段可以缩短到 50 bp 左右34。 图 4 ZFN 靶位点切割和同源重组机制18 左边是 X 射线引起的 DNA 双链断裂修复, 右边是 ZFN 引起的 DNA 双链断裂修复 。 4 应用 ZFN 引入外源基因片段或者对靶基 因进行突变 Porteus 等35首先将荧光蛋白的编码区中插入一 段 DNA, 形成荧光蛋白突变体(M-GFP), 然后将这 段突变荧光蛋白基因整合到 HEK 293 细胞的基因组 中, 形成稳定的 GFP 突变细胞。该 GFP 突变细胞没 有检测到 GFP 荧光。 使用含有 GFP 同源序列的载体 (C-GFP)转染 GFP 突变细胞, 发现自发的同源重组 非常低(Spontaneous gene targeting, S-GT)。 因为 GFP 突变序列上含有一段 I-SceI 核酸酶的识别位点, 因 此将 I-SceI 和 C-GFP 共转染 GFP 突变细胞后, I-SceI 切割 M-GFP 上的靶位点, 导致靶位点 DNA 双链断 裂, 引发靶位点同源重组(Double strand break gene targeting, DSB-GT)。测定表明 DSB-GT 的细胞是 S-GT 的细胞的 2 000 倍, 因此 DSB-GT 制造的基因 打靶效率要远远高于传统的随机整合方法。针对 M-GFP 上的插入序列设计特异性的 ZFN, 然后观察 由 ZFN 所引发的 DSB-GT。 因为 ZFN 是以二聚体的 形式切割靶位点(图 3), 所以左右靶位点的间隔长度, 还有 ZFN 中锌指结构域与核酸酶结构域之间的 Linker 长度对切割效率会有影响。Porteus 设计了两 种 M-GFP 突变细胞, 分别是左右靶位点的间隔长度 为 6 bp(M-GFP6)和间隔 8 bp(M-GFP8)的突变细胞。 同时作者还设计了 3 种 ZFN, 分别是 Linker 长度为 0、3、18 的 ZFN(ZFNL0、ZFNL3、ZFNL18)。实验 表明 ZFNL0 对 M-GFP6 的切割效率非常高, 与 I-SceI 切割效率相比, 引发的 DSB-GT 约为 70%。 由 此可以推测在设计 ZFN 时, 左右靶位点的间隔不能 太长。 Bibikova 等36设计了一对三锌指结构域的 ZFN, 识别位于果蝇 X 性染色体的 yellow 基因第二外显 子。单独转染 ZFN 到果蝇的胚胎, 发现有一半的雄 性果蝇发生突变。在这些果蝇中有 5.7%的个体恢复 了正常颜色, 其他的突变导致了颜色的改变。突变 是由于 ZFN 引发靶位点断裂后, 细胞发生了非同源 末端连接(NHEJ)。 此外, 作者还将 ZFN 和 yellow 基 因的同源序列共转染果蝇的胚胎, 结果发现雄性果 蝇有2%的子代发生了突变, 突变原因是同源重组的 占 63%, 雌性的果蝇子代的同源重组突变占 73%。 因此 ZFN 在雄性和雌性胚胎突变中效率没有差别, ZFN 引发了体细胞和性细胞的突变37。 Urnov 等3使用 ZFN 切割人的体细胞基因组上 的靶点, 获得了 20%的同源重组效率。首先作者用 HEK 293 GFP 突变细胞(M-GFP), 作为测试体系, 发现 ZFN 和同源基因片段共转染的情况下, 约有 10.2%的细胞发生了 DSB-GT。然后作者针对人内源 基因 IL2R 设计了带 4 个锌指结构域的 ZFN, 一对 ZFN 共识别 24 个碱基。 将人工设计的 ZFN 和 IL2R 同源基因片段共转染K562细胞, 结果发现20%的细 胞发生了同源重组, 该结果在 mRNA 和蛋白质水平 得到了验证。作者还将 ZFN 和 IL2R 同源基因片段 共转染 CD4+ T 原代细胞, 结果发现有 5.3%的细胞 发生了同源重组, 考虑到 T 细胞较低的转染效率, 发生这样比率的同源重组已经很高了。 Doyon 等4针对 T 盒转录因子(ntla: no tail)和 gol 基因设计了带 4 个锌指结构域的 ZFN, 使用酶联免 疫方法(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELASA) 和酵母报告系统鉴定准确切割靶 DNA 的 ZFN。转 染 ZFN 的 mRNA 到一细胞期的斑马鱼胚胎中, 导致 20%的靶位点发生突变, 没有脱靶现象。 Meng 等5针对斑马鱼血管内皮细胞生长因子受 体基因(Vascular endothelial growth factor-2 receptor, VEGF)设计了带 3 个锌指结构域的 ZFN, 识别靶位 点 9 个 bp, 左右靶位点之间间隔 6 bp, 因此一对 ZFN 共识别 24 bp 的靶位点。该靶位点位于 VEGF 基因的第二外显子上。 转染 ZFN 的 mRNA 到一细胞 期的斑马鱼胚胎中, 导致很高的突变效率, 虽然突 128 HEREDITAS (Beijing) 2011 第 33 卷 变存在脱靶现象, 但是实验结果表明可以直接注射 mRNA 到脊椎动物胚胎中, 实现基因打靶。 Foley 等6使用 OPEN(Oligomerized pool engi- neering)技术针对斑马鱼的 5 个内源性基因(dopamine transporter : dat; hypoxia-inducible factor 1a: hif1aa; telomerase; transferring receptor2 : tfr2; gridlock)设 计了特异识别的 ZFN, 将 100200 pg 的 ZFN mRNA 注射到斑马鱼胚胎中, 约 0%27%的胚胎死 亡, 胚胎死亡率明显低于 Meng 等5的结果。而且, 5 个内源性基因的突变率约为 3%20%。通过计算发 现, 理论上斑马鱼约 86%的转录本可以使用 OPEN 技术设计特异性的 ZFN, 用于定点突变。 Hockemeyer 等7对人的 POU5F1、PPP1R12C 和 PITX3 基因设计了特异性的 ZFN, 在胚胎干细胞和 诱导多功能干细胞中进行了基因打靶实验。外源基 因片段带一个发光标记和抗嘌呤霉素筛选标记, 这 些外源基因能稳定地整合到靶点上, 并且正常表 达。其中整合到 POU5F1 位点的报告基因的表达模 式与野生型 POU5F1 基因的表达模式一致。 Cost 等8使用 ZFN 定点敲除了 CHO 细胞的 BAX 和 BAK 基因。因为 BAX 和 BAK 基因的表达可以增 加线粒体膜的通透性, 因此减少 BAX 和 BAK 基因 的表达, 可以减缓细胞色素 c 向细胞质中释放, 从 而使得细胞凋亡过程减缓。 因此敲除了 BAX 和 BAK 基因的 CHO 细胞能够耐受饥饿和高酸碱环境。 此外 ZFN 已经被用于植物的定点突变和基因改 造中38, 39。 以上研究表明 ZFN 作为基因打靶手段在 动植物育种中具有广泛的应用前景。 5 结语与展望 ZFN 技术发展到现在, 已经逐渐走向成熟。这 项技术的基础是 ZFP 对靶 DNA 的特异性识别。实 验方法已经鉴定出许多高亲和力的 ZFP(表 1), 这些 ZFP 可以作为设计锌指蛋白的基础11。ZFP 对基因 组的非特异性识别是导致脱靶的主要原因, ZFN 对 非特异性位点的切割导致细胞毒性和基因毒性, 这 严重地制约了 ZFN 的广泛应用。对于基因治疗等对 ZFP 特异性要求很高的应用, 需要发展更高特异性 的 ZFP。另外, 设计一个特异性的 ZFP 还很费时费 力, 这极大地增加了使用 ZFP 的成本。但是采用 OPEN 技术设计的 ZFP 具有很高的亲和力和较低的 脱靶率6, 已经能够满足应用的需要。 虽然 OPEN 技 术表现不凡, 但是它会受限于已知的高亲和力的 ZFP, 由于存在脱靶现象, 往往需要针对一个靶点设 计多对 ZFP, 然后检测脱靶率。因此将来的 ZFP 研 究更多的会侧重于寻找高特异性的 ZFP, 以及最优 的 ZFP 组合方式, 这样可以大大减少实验设计和验 证的工作量。 参考文献(References): 1 Jasin M. 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