组织工程与生物材料

组织工程与生物材料,概述,细胞培养,组织工程支架材料,支架材料制备技术,4,1,2,3,组织工程学：应用工程学和生命科学的原理与方法,研究和开发具有生物活性的人工替代物，达到修复、维持或改善损伤组织功能的一门科学。（Langer和Vacantil，1993年，）,概述,基本方法：将在体外培养、扩增的功能相关的活细胞种植于多孔支架上,细胞在支架上增殖、分化,构建生物替代物,然后将之移植到组织病损部位,种植的细胞在生物支架逐步降解吸收过程中，继续增生繁殖，形成了新的具有其原来特殊功能和形态的相应组织和器官，达到修复创伤和重建功能的目的。,概述,组织工程再生过程：提取自体细胞，繁殖细胞，将细胞移植在合适的支架上并控制其生长因子，细胞培育，将支架移植的需要修复的组织内,核心：建立由细胞和生物材料构成的三维复合体,三要素：种子细胞、信号因子(细胞因子或生长因子)和支架材料,概述,概述,1.特定组织的细胞特定组织的细胞是指从供体组织的健康部位收集个体细胞，分离后，再移植到患者所需要的部位。细胞移植与整个器官移植相比具有明显的优势：仅仅需要很少量的供体细胞就可进行移植；活的供体不必牺牲整个器官；分离细胞的用处可以排除易发生免疫反应的细胞类型；成本低。,概述,2.细胞生长因子在组织器官的再造中，各类组织诱导因子、生长因子和血管形成刺激因子将有利于组织的形成。例如，促进骨细胞的分化与再生的是一些蛋白质生长因子，其中起主要作用的是骨形态发生蛋白(BMP)。这种活性蛋白质可诱导血管周围游动间充质细胞转转化为不可逆性骨系细胞,如何将生长因子与载体组合成生长因子的释放系统，是组织工程中有效利用生长因子的关键。,概述,3.组织工程支架材料（细胞载体材料）分离的细胞自身不可能形成组织，它们需要特殊的环境，通常包括细胞生长临时的支架材料。这种三维支架材料常常模拟其自然对应物一体内的细胞外基质(ECM)，它们既起物理支架的作用，又是实质细胞在体外培养和后期植入的粘附物质。,细胞载体材料是利用组织工程技术再造人类器官的物质基础，是组织工程技术中研究的关键。,概述,细胞培养是指从体内取出的细胞或组织在模拟体内生理环境，于无菌、合适温度和一定营养条件下在体外培养，使其生存、生长、增殖，并保持其结构和功能的方法。它包括从活体中取出的细胞或已建立的细胞系在体外培养生长、增强，但不再分化为组织。,细胞培养,（一）无污染环境无毒和无菌是保证细胞生存的首要条件。（二）基本的营养物质(1)所有细胞均需要的各种氨基酸(2)含有适当的葡萄糖以维持细胞代谢及产生能量(3)必需的维生素(4)钠、钾、钙、镁等无机盐类及Fe、Zn、Se等微量元素在大多数培养基中需加入血清，如小牛血清等。为了防止细菌感染，有时加入适量的抗生素(如青、链霉素)。,细胞培养的基本条件,细胞培养,（三）温度最适宜温度为3537C。偏离此范围，细胞的正常代谢和生长受影响。一般来说，细胞对低温的耐受力较高温强。温度不低于0C时，细胞代谢随温度降低而减慢，对细胞无伤害作用，一旦再置于37C培养，细胞仍能生长。如温度降至冰点以下时，细胞可因胞质结冰而死亡，但如向培养基中加入保护剂(二甲基亚砜DMSO或甘油)，封入安瓶中，即可在液氟中冷冻储存(温度达-196C)，复苏后仍能继续生长。,细胞培养,细胞培养的基本条件,（四）气体环境和氢离于浓度所需气体主要是O2和CO2。大多数培养细胞适宜的pH值为7.27.4，低于6.8或高于7.6对细胞不利，甚至导致细胞死亡。对多数细胞来说，在偏酸环境中更细胞生长。为维持培养基pH值的稳定，常以CO2HCO3-和磷酸缓冲液体系来完成。（五）渗透压大多数细胞对渗透压有一定耐受性。对绝大多数细胞来说，最适宜渗透压为230-320mOsm/kg。,细胞培养,细胞培养的基本条件,细胞培养,组织工程支架作为组织工程的平台，不仅提供了细胞生长的框架，使之形成特定的组织或器官形状;而且作为细胞外基质成分之一，是细胞间信号传导和相互作用的媒介，同时也是细胞生长所必需的生物活性剂。,组织工程支架材料,良好的生物相容性，在生物体内不会引起炎症或致畸反应合适的孔尺寸、高孔隙率和相连的孔形态，以适于细胞的黏附和生长，细胞间的信号传导，养分传送，以及降解产物和新陈代谢产物的排出，以及血管和神经的长入。高的表面积和合适的表面理化性质以利于细胞粘附、增殖和分化,以及负载生长因子等生物信号分子特定的三维外形（厚度和形状）合适的可生物降解吸收性与植入部位组织力学性能相匹配的结构强度,一、组织工程支架的基本条件（设计要求）：,组织工程支架材料,二、支架材料的原料（1）天然可降解高分子材料。如胶原（collagen），其本身就是天然骨的组织成分。壳聚糖（chitosan），是甲壳素的衍生物。还有明胶、琼脂、葡聚糖、透明质酸。降解产物易被机体吸收，但强度和加工性能较差，降解速度无法调节。（2）天然可降解无机材料。例如珊瑚是天然动物的骨骼，其中99是磷酸钙。再如，珊瑚羟基磷灰石（CHA）。它们都具有天然珊瑚的多孔结构，有较好的孔隙率。能和靶细胞很好的黏附，而不影响增殖、分化、成骨。但加工困难。,组织工程支架材料,二、支架材料的原料（3）合成可降解高分子材料。常用的可降解合成高分子材料有聚乳酸poly(lacticacid),PLA,聚乙醇酸poly(glycolicacid),PGA,聚己内酯(polycaprolactam,PCL)等。这类材料的降解产物可在体内代谢排除，对机体无害，可塑性较好。（4）合成可降解无机材料。常用的主要有磷酸钙水泥(calciumphosphatecement,CPC)，羟基磷灰石(hydroxyapatite,HA),磷酸三钙(tricalciumphosphate,TCP),生物活性陶瓷如生物活性玻璃陶瓷(biologicalactivityceramicglass,BCG),细胞外基质陶瓷类材料等。（5）复合材料。如:聚乳酸羟基磷灰石,组织工程支架材料,组织工程支架材料,Singlechainofcollagen,胶原collagen,组织工程支架材料,SEMimagesofcollagenHAbiocomposite.Non-dehydrated,non-irradiatedsamplecorrespondingtoacollagen/HAproportionof1/1.Collagenisorganizedasfibersbothattachedtotheparticlessurfacesorlinkingdifferentparticles;bar:100m.AbundleofalignedcollagenfibersoverasmoothareaofHA.GraincontoursareseenintheHAsurface;bar:5m.(c)Dehydrated,re-hydratedandirradiatedsamplecorrespondingtoacollagen/HAproportionof1/2.6.InthiscasecollagenformsacompactmeshwidelyadheredtoHAsurface;bar:50m.,组织工程支架材料,Polygonalosteoblastspartiallycoveringthecompositesurface,11daysafterseeding;bar:50m.,组织工程支架材料,Osteoblastsattachedtocollagenfibers(a)connectingtwoadjacentboneparticles(bar:10m)and(b)details(bar:5m)11daysafterseeding.,组织工程支架材料,壳聚糖/磷酸三钙(TCP)复合支架,壳聚糖是甲壳素脱乙酰化产物，结构与细胞外基质成分糖胺聚糖相似，具有良好的生物相容性和可调节的生物降解性，可有效增强骨前体细胞的分化能力并促进骨形成过程。但用于硬组织修复时强度不足。,组织工程支架材料,TCP增强壳聚糖支架材料，该复合支架内部形成大孔和互连的小孔，TCP的含量决定了孔的大小，形态和支架的力学性能。在模拟体液中浸泡4周后，复合支架表面可形成低结晶度的磷灰石矿化层，有利于体内硬组织的重建。,SEMphotosof(a)purechitosanscaffoldsandchitosan/TCP/glasscompositescaffoldswithweightratiosof(b)90/10/0,(c)50/50/0,(d)30/70/0,(e)90/5/5,and(f)90/0/10JournalofBoneandMineralResearch,55:304-312,2001,聚（乳酸-乙醇酸）（PLGA）,通过改变共聚物中乳酸和乙醇酸的相对含量，可以调节聚合物的结晶结构和亲疏水性，进而决定支架材料在体内的降解速率。,组织工程支架材料,三、支架材料的应用（一）骨组织工程支架材料人的骨头在人体中起一支撑人体重量，维持人体力学平衡的功能，因此，人工骨的组织工程支架材料必须具备以下两个功能。（1）有一定机械强度以支撑组织的高强度材料，以保证材料植入人体后，有支撑体的重量，不改变骨骼形状。（2）有一定生物活性(具有骨传导性或骨诱导性)可诱导细胞生长、分化，并可被人体降解吸收。以上对骨支架材料要求的条件可以归结为：骨组织工程支架材料是具有一定强度并具有生物活性的可降解材料。,组织工程支架材料,三、支架材料的应用（二）神经组织工程支架材料周围或中枢神经缺损至今仍是未解决的世界性难题,由于神经需要再次生长出神经元,轴突等结构才能恢复功能,而不能依靠癫痕或者其他纤维组织的渗入来单纯的填充受损部位。因此神经组织再生区别于其他组织再生,神经的修复方法也有其特殊性。神经支架材料的功能有两种：（1）必须为神经的恢复提供所需的三维空间，即要保证神经导管具有合适的强度、硬度和弹性，使神经具有再生的通道。,组织工程支架材料,三、支架材料的应用（二）神经组织工程支架材料（2）要保证其有理想的双层结构：外层提供必要的强度，为毛细血管和纤维组织长入提供营养的大孔结构；内层则可起到防止结缔组织长入而起屏障作用的紧密结构。因此，神经修复所用支架材料一般为：外层是强度大、降解速率慢的可降解材料，内层为具有细胞生长活性的降解材料。用于神经修复的内层材料多为胶原和多糖。目前研究和使用的多为胶原和聚乳酸的复合材料。,组织工程支架材料,三、支架材料的应用（二）神经组织工程支架材料（2）要保证其有理想的双层结构：外层提供必要的强度，为毛细血管和纤维组织长入提供营养的大孔结构；内层则可起到防止结缔组织长入而起屏障作用的紧密结构。因此，神经修复所用支架材料一般为：外层是强度大、降解速率慢的可降解材料，内层为具有细胞生长活性的降解材料。用于神经修复的内层材料多为胶原和多糖。目前研究和使用的多为胶原和聚乳酸的复合材料。,组织工程支架材料,三、支架材料的应用（三）血管组织工程支架材料血管支架材料类似于神经支架材料，其结构上也分为双层，但内层不同于神经支架材料的是其为与血液相容性好的生物活性材料。目前，应用较多的为表面处理的可降解材料的无纺网，例如：聚乳酸、聚羟基酸和多肽等的无纺布或无纺网等。在血管假体内表面涂布硫酸软骨素（CS）及透明质酸（HA），外表面涂以明胶层，以达到内表面抗血小板、血细胞吸附，外表面吸引周围组织长入的目的。,组织工程支架材料,三、支架材料的应用（四）皮肤组织工程支架材料人工皮肤材料：胶原-硫酸软骨素，壳聚糖-明胶双层支架。（五）角膜组织工程支架材料人工角膜材料要求透明，吸水，有一定的机械强度，屈光性好等特点，同时，要求可降解，多采用胶原和聚醇酸等材料。（六）肝、胰、肾、泌尿系统组织工程支架材料肝、胰、肾、泌尿系统使用的组织工程支架材料主要以天然蛋白、多糖与合成高聚物复合的可降解材料。例如：用于肝组织工程支架的血纤维蛋白和聚乳酸，用于泌尿系统的聚乙醇酸等。,组织工程支架材料,一、无纺织物/纤维黏结法纤维支架是组织工程研究中最早采用的细胞外基质替代物之一，主要由PGA或其共聚物等结晶性聚合物纤维构成。利用纺织技术将直径1015m的纤维制成织物或无纺物，其孔隙率高达97%，拥有高比表面积，但存在力学强度较差、承压时会坍塌的缺点。,支架材料制备技术,壳聚糖及半乳糖化壳聚糖纳米纤维支架,胶原涂敷的PLLA无序及有序纤维支架,海藻酸钠纳米纤维支架,PCL及PLGA纳米纤维支架,纳米纤维支架,支架材料制备技术,二、溶液浇铸粒子沥滤法首先将组织工程材料和致孔剂粒子制成均匀的混合物，然后利用二者不同的溶解性或挥发性，将致孔剂粒子除去，于是粒子所占有的空间变为孔隙。致孔剂粒子可采用氯化钠、酒石酸钠和柠檬酸钠等水溶性无机盐或糖粒子，也可用石蜡粒子或冰粒子。,支架材料制备技术,二、溶液浇铸粒子沥滤法聚合物溶液与均一的盐晶混合溶剂挥发后形成固体的聚合物/盐复合物浸没在水中去除盐可控孔隙率达93%（厚度2mm）,当盐晶含量为7090时，有均匀的联孔结构,支架材料制备技术,ScanningelectronmicrographofthefracturedsurfaceofaconduitfabricatedfromPLGAandsaltcrystalsBiomaterials,Widmer等对此法进行了改进，将多孔膜用溶剂溶解在一起形成三维立体结构后，结合挤出技术，可制备出PLLA、PLGA多孔聚合物导管。可用于修复神经、长骨、肠或血管等管状组织。,支架材料制备技术,三、相分离冷冻干燥法相分离法是指将聚合物溶液、乳液或水凝胶在低温下冷冻，冷冻过程中发生相分离，形成富溶剂相和富聚合物相，然后经冷冻干燥除去溶剂而形成多孔结构的方法。因而，又称为冷冻干燥法。按体系形态的不同可简单地分为乳液冷冻干燥法、溶液冷冻干燥法和水凝胶冷冻干燥法。,支架材料制备技术,LowvoltageSEMsofPLGAscaloldsusedininvitroproteinrelease.Biomaterials,乳液冷冻干燥,Whang等将水与聚合物溶液一起均化得到油包水乳液，并浇铸到模具中，冷冻干燥脱除水分和溶剂，得到多孔支架。支架孔隙率为9095，大孔尺寸达200m，溶剂挥发还会形成0.01m以下的微孔，孔表面积达58102m2g-1，为相连的孔结构。孔结构的影响因素主要有油水比和聚合物分子量。,支架材料制备技术,SEMmicrographsoftubularscalolds.Biomaterials,溶液冷冻干燥,Sundararajan等将壳聚糖溶于0.2mol/L的醋酸溶液中，将得到的溶液装在平底玻璃器皿中用液氮冷冻（冷冻温度为-78）干燥后除掉醋酸。经测试所制得的多孔膜支架孔径为40250m。通过改变冷冻温度和壳聚糖溶液的浓度可以有效地改善支架的孔形态。,支架材料制备技术,DigitalphotographsandSEMmicrographsofcrosssectionofgelatinscaffoldActaBiomaterialia,水凝胶冷冻干燥,Gao等人将明胶溶解于热水，用少量戊二醛稀溶液交联形成凝胶后，经冷冻干燥制得三维网络结构的支架材料。具有单轴微管状孔结构，孔隙率高达98%以上。通过调节明胶溶液和交联剂的浓度可改变孔隙率。,支架材料制备技术,Photosofgel,aerogelandxerogel,水凝胶冷冻干燥,支架材料制备技术,不同温度下，多步相分离粗化，提高孔尺寸、连通性,相分离/冷冻干燥法孔尺寸往往偏小，但该法避免了高温，因而得到了研究者的重视。,改进：,三、相分离冷冻干燥法,支架材料制备技术,超临界二氧化碳（SCCO2）无残留溶剂制备非晶相聚合物支架,四、气体发泡法超临界流体技术（物理发泡法）该法将聚合物压成片,浸泡在高压二氧化碳中直至饱和,甚至超临界状态,然后降至常压,气体的热力学不稳定性导致气泡成核和增长,形成多孔支架。,支架材料制备技术,优点：不使用有机溶剂，因为残留在支架中的有机溶剂对细胞有害;反应体系可以在比较低的温度下进行（3040C）,便于药物和生长因子的粘附。缺点：支架的孔隙率和孔径不可控，由气体在固体中溶解/释放过程的形态决定；连通率低（1030）；闭孔结构，可联合粒子浸滤法改进。,支架材料制备技术,Shea等人将发泡法和与粒子浸出法相结合，可制得相连的开孔结构的多孔支架，这样形成多孔支架孔隙率约为95%。将血管内皮生长因子（VEGF）结合到制备的PLGA支架上，70d内，观察到VEGF持续释放，释放的生长因子90%以上的生物活性被保留下来了。发泡法中影响孔隙率和孔结构的因素主要有聚合物的结晶性和分子量、平衡时间、放气速率。,应用气体发泡/粒子浸出法所得PLGA支架的典型结构JournalofControlledRelease,支架材料制备技术,四、气体发泡法化学发泡法采用的化学发泡剂主要为碳酸盐类化合物。将聚合物溶液/碳酸氢铵粒子混合物加入到模具中,待溶剂部分挥发后直接浸入热水中发泡,最后经冷冻干燥可得到多孔支架。该法得到的多孔支架孔隙率超过90%,孔相连性好,孔尺寸约100500m,并避免了表面皮层的形成，其肝细胞种植率高达95%。,支架材料制备技术,利用化学发泡法制备得到的PLLA多孔支架材料的表面和横截面的SEM图，以及人工骨