第六章-转录PPT课件

.,1,第6章转录(Transcription),.,2,转录概述,特点：RNA在DNA模板上的酶促合成；,只用一条DNA链作模板；,RNA合成按照一固定方向合成：53；,.,3,有义链（sensestrand),编码链（codingstrand）与转录出来RNA顺序一致，但U代替了T,反义链(antisensestrand),模板链(templatestrand)DNA两条链中有一条链作为模板转录为RNA，不同基因使用不同链作模板,.,4,几个概念,原初转录物（primarytranscript）：与转录单位对应的未加工的RNA。转录单位（transcriptionunit）：RNA聚合酶转录起始和终止点之间的序列，可大于一个基因。启动子（promoter）：与RNA聚合酶结合，作为起始转录的DNA序列。,.,5,转录单位（transcriptionunit）,起点（startpoint）上游（upstream)下游(downstream）,.,6,转录的一般过程：RNA合成在转录泡中进行，其中一条DNA作为模板。,.,7,第一节转录由RNA聚合酶催化,RNA聚合酶内部的bubble结构：聚合酶前进时，将前端的DNA双链解旋，在后方则重新结合。bubble长度在1214bp变化，而其中RNA-DNA杂交区长度在89bp。,.,8,1.转录发生在转录泡内，分四个阶段,转录的不同阶段：模板识别(Templaterecognition)起始(Initiation)延伸(Elongation)阶段终止(Termination),.,9,模板识别：RNA聚合酶与双链DNA的启动子结合,起始：有一小段RNA（9bp）合成并释放，然后开始合成RNA,延伸：RNA聚合酶合成RNA,终止：转录泡崩解，聚合酶和RNA释放,.,10,2.细菌（E.coli）的RNA聚合酶全酶：,E.coliRNA聚合酶具有四种亚单位；在不同种属中、的大小相对保守，的大小各异,2：465kD,和亚基：催化中心，构成核酸通道；,亚基：核心酶组装所需；也与调节因子作用；,亚基：启动子识别，具有启动子特异性。,.,11,第二节转录的启动,全酶(2)可被分为两部分：核心酶(2)和因子(sigma因子，多肽)全酶(Holoenzyme)起始转录。因子能够保证细菌RNA聚合酶稳定地结合到某个特异的、唯一的DNA启动子上。,1.因子控制酶与DNA的结合,.,12,RNA聚合酶包括核心酶（coreenzyme）和因子,核心酶,.,13,2.因子的作用：,因子改变了RNA聚合酶结合DNA的性质，使得它对一般的DNA的亲和力降低，而对启动子的亲和力增加因子还具有识别特异结合位点的能力,因子特异识别启动,.,14,转录延伸之前，RNA聚合酶要经过数个步骤：闭合二元复合物转化为开放二元复合物，开放二元复合物再转化为三元复合物。,.,15,起始复合物：RNA聚合酶与-55到+20之间的区域接触，占据7580bp,起始延伸复合物：在10bp内，因子可能缺失，核心酶丧失与-3555的序列结合。,接着核心酶稍稍向前移动，结构逐渐致密并最终形成延伸复合物,.,16,3.启动子识别依赖同源序列,细菌启动子有4个保守特征：起始位点、-10区、-35区以及-10和-35区之间间隔距离。,.,17,6/7/2020,细菌启动子特征：,1、起始位点通常是一个嘌呤；,2、起点上游10bp处，有一约6bp的保守区域，称为-10区（也叫PribnowBox），共有序列为：T80A95T45A60A50T96；,3、起点上游35bp处，有一约6bp的保守区，称为-35区，共有序列为：T82T84G78A65C54A45；4、90%的启动子中，-10与-35区的距离在16-19bp之间；两个保守区之间的序列并不重要，但距离很关键。,.,18,.,19,4.因子的更替可控制转录起始,正常情况下负责大多数基因转录的是70不同的因子在不同条件下执行功能,.,20,T,32,蛋白部分变性,rpoH表达,热激蛋白基因转录,热激反应（heatshockresponse）,正常条件下，核心酶与70结合，转录普通基因；,32可与70竞争核心酶，并可迅速降解。,温度升高后，新的转录因子表达，激活热激基因的表达。,.,21,E因子控制比32更剧烈的温度变化应答54因子在氮源缺乏的情况下发挥作用。,.,22,第三节细菌RNA聚合酶的终止,.,23,终止子（terminator）：终止RNA合成反应所需的DNA序列；在转录结束的位点，提供终止信号。一些与聚合酶特异结合的因子(如pN/pQ)可阻止终止事件的发生（抗终止,antitermination）。终止被用于控制基因表达。RNA合成的终止实际依赖于已转录的RNA序列。,.,24,1.E.coli中的终止子分为两种类型：,内源性终止子有两个明显的结构特点:,1)二级结构中的发夹（hairpin）结构(720bp),2)转录单位最末端的连续约6个U残基的区段。,这两个特点都是终止所必需的。发夹的基底部通常包含一个富含G:C区,1.1没有任何其它因子参与，核心酶也能在某些位点终止转录，这些位点被称为“内源性终止子(Intrinsicterminator)”。,.,25,.,26,1.2“-依赖型终止子”：需要因子的辅助,.,27,2.因子如何行使功能,因子是E.coli的一种基本蛋白质，只在终止阶段发挥作用-依赖型终止作用所需的序列长5090个碱基，位于终止子上游。它们的共同特征是RNA富含C而G很少。有ATP酶活性，但这种活性依赖于RNA.,.,28,序列特征：有一富含C而少G的序列,.,29,RNA聚合酶沿模板移动,沿RNA链移动；,RNA聚合酶在终止子处暂停；,因子追上聚合酶并使之解离，并拆分RNA-DNA杂交链,.,30,第四节真核生物转录,.,31,瑞典皇家科学院诺贝尔奖评委会2006年10月4日宣布,将2006年诺贝尔化学奖授予美国科学家罗杰科恩伯格(RogerD.Kornberg),以奖励他在“真核转录的分子基础”(molecularbasisofeukaryotictranscription)研究领域做出的贡献。,罗杰科恩伯格(RogerD.Kornberg),.,32,信使RNA的合成过程图,.,33,Kornberg跟随FrancisCrick(1962年诺贝尔生理学奖医学奖获得者)和AaronKlug,在英国医学研究理事会分子生物学实验室做博士后研究时就接触到了转录领域。1974年,他观察到组蛋白H3和H4在溶液中形成(H3)2(H4)2形式的四聚体,同年提出染色质的基本单位核小体是由1个组蛋白八聚体和DNA的200个碱基对组成,并于1977年对这个染色质模型作出补充,是迄今为止最基本的一种染色质模型。Kornberg回到斯坦福大学后继续了真核细胞转录调控的研究,并决定利用酵母细胞作为真核状态下的有机体模型,发展一个在生物体外的转录体系。他的研究组用了长达10年的时间来调整这个体系,使之用于研究真核转录过程。研究发现:当这个体系含有高度纯化的RNA聚合酶及5个通用转录因子和TATA结合蛋白(TBP)时,只支持基本的转录,对特殊基因的活化蛋白(genespecificactivatorprotein)不起反应。这就意外地导致了对调节介质(mediator)由近20种不同蛋白质组成的多蛋白质复合体的发现和纯化。这个发现无疑是理解转录过程的一个真正意义上的里程碑。在所有真核生物的细胞中,调节介质的作用就是传递来自转录激活物的信号,因而对转录起着开关的作用。至此,基因调控和真核细胞转录过程中必需的3个成分得以确立:通用转录因子调节介质、RNA聚合酶。,.,34,Kornberg于2001年绘制的真核转录过程图,.,35,真核细胞的三种RNA聚合酶,.,36,.,37,某些常用的转录抑制剂,.,38,RNApol执行多功能,(1)识别DNA双链上的启动子；(2)使DNA变性在启动子处解旋成单链；(3)通过阅读启动子序列，RNApol确定它自己的转录方向和模板链。(4)催化适当的NTP以3、5磷酸二酯键相连接，如此连续进行聚合反应完成一条RNA转录本的合成。(5)最后当它达到终止子时，通过识别停止转录。RNA聚合酶还参与了转录水平的调控。,.,39,.,40,二、真核生物的启动子1、RNA聚合酶I的启动子-40+5为近启动子-165-40为远启动子2、RNA聚合酶II的启动子第一个部位为帽子位点第二个部位为TATA盒又称Goldberg-Hogness盒共有序列为TATAAAA第三个部位为CAAT盒，共有序列为GGTCAATCT第四个部位为增强子3、RNA聚合酶III的启动子,.,41,2.真核生物的启动子,真核生物的启动子与原核生物的启动子相似，也具有两个高度保守的共有序列。其一是在-25附近的一段AT富集序列，其共有序列是TATAA，称为TATA盒。TATA盒与原核的Pribonow盒相似，是转录因子与DNA分子结合的部位。其二是在多数启动子中，-70附近共有序列CAAT区，称为CAAT盒。除以上两个区域外，有些启动子上游中含有GC盒，此GC盒与CAAT盒多位于-40110之间，它们可影响转录起始的频率。另外，有少量基因缺乏TATA盒，而由起始序列（Inr）与RNA聚合酶直接作用启动基础转录的开始。,.,42,RNA聚合酶III的启动子有两类：一类是结构基因内启动子；一类是结构基因外启动子。,.,43,识别RNA聚合酶III所需的一些辅助因子：TFATFB和TFC,RNA聚合酶的启动子,.,44,转录因子,真核生物在转录时往往需要多种蛋白质因子的协助。(参考书82页图3-6),.,45,1.转录调节因子分类（按功能特性）,*基本转录因子(generaltranscriptionfactors),是RNA聚合酶结合启动子所必需的一组蛋白因子，决定三种RNA(mRNA、tRNA及rRNA)转录的类别。,.,46,*特异转录因子(specialtranscriptionfactors),为个别基因转录所必需，决定该基因的时间、空间特异性表达。,转录激活因子,转录抑制因子,.,47,2.转录调节因子结构,.,48,最常见的DNA结合域,1.锌指(zincfinger),CCysHHis,常结合GC盒,.,49,Zn,Cys,His,.,50,2.-螺旋,常结合CAAT盒,.,51,增强子:增强子是长约100200bp的序列，它们与启动子不同，可以位于转录起始位点的上游，也可位于其下游。,增强子能大大增强启动子的活性。各个基因中的增强子顺序差别较大，但有一个基本的核心顺序(coresequence)：AAAGGTGTGGGTTTGG增强子具有组织特异性所有的增强子中均有一段由交替的嘧啶-嘌